Введение
Список используемых сокращений 5
1. Введение 7
1.1 Актуальность работы 7
1.2 Цели и задачи исследования 8
1.3 Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы 9
1.4 Положения, выносимые на защиту 10
1.5 Степень достоверности и апробация результатов 10
2. Обзор литературы 12
2.1 Роль C-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II в организации транскрипционного комплекса 14
2.2 Распределение фосфорилирования C-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II как маркер стадии транскрипции 17
2.3 Процесс кэпирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события 20
2.4 Ко-транскрипционный сплайсинг 22
2.5 Процессинг 3-конца мРНК 25
2.6 Упаковка транскрипта и связь с другими ко-транскрипционными процессами 28
2.7 Расщепление/полиаденилирование детерминирует терминацию транскрипции 30
2.8 Формирование петель у генов 31
3. Материалы и методы 33
3.1 Объекты 33
3.2 Молекулярное клонирование 33
3.2.1 Работа с бактериями 33
3.2.2 Общие методы работы с ДНК 34
3.2.3 Создание векторов с репортерной системой 38
3.3 Работа с культурой клеток S2 дрозофилы 39
3.3.1 Ведение культуры клеток S2 Drosophila melanogaster 39
3.3.2 Трансфекция клеток культуры S2 Drosophila melanogaster 39
3.4 Измерение активности люцифераз 39
3.5 Работа с РНК 40
3.5.1 Выделение РНК 40
3.5.2 Разделение ядерной и цитоплазматической фракций РНК 40
3.5.3 Нозерн-блот анализ 41
3.5.4 Количественная ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени 43
3.6 Генетические методы 45
3.6.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий 45
3.6.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях 46
3.6.3 Генетические скрещивания 46
3.7 Методы компьютерной обработки данных 47
3.7.1 Предсказание СПА 47
3.7.2 Поиск генов, полностью расположенных в интроне другого гена 48
3.7.3 Анализ паттерна экспрессии изоформ на основе данных секвенирования РНК 48
Результаты 49
4.1 СПА широко представлены в интронах Drosophila melanogaster 49
4.2 Экспериментальное подтверждение функционирования СПА в экзонах, но не в интронах генов 54
44.3 СПА, встроенные в интрон, функционально выключены 57
4.3.1 Создание модельной системы для определения эффективности работы СПА 57
4.3.2 Проверка активности СПА в модельной системе 60
4.3.3 Установление особенностей работы терминатора в интроне гена yellow 63
4.3.4 Исследование активности инсулятора 1А2 и сигнала полиаденилирования в интроне гена yellow в трансгенных линиях Drosophila melanogaster 64
4.3.5 Проверка активности СПА внутри искусственного интрона 69
4.4 Использование СПА внутри интронов - редкое явление в геноме и, по всей
видимости, является индуцибельным 71
5. Обсуждение 76
6. Выводы 80
Список цитированной литературы 81
