Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Мировой опыт по разработке вакцины против ВИЧ 17
1.2. Дизайн вакцины для индукции Т-клеточного иммунного 25 ответа против ВИЧ-1
1.2.1. Особенности презентации Т-клеточных вакцин 25
1.2.2. Разрабатываемые полиэпитопные вакцины против ВИЧ-1 28 для индукции Т-клеточного ответа
1.2.3. Стратегии конструирования полиэпитопных вакцин 34
1.3. Методы исследования Т-клеточного иммунного ответа 40
1.3.1. Методы исследования Т-клеточной пролиферации 40
1.3.2. Методы исследования клеточной цитотоксичности 42
1.3.3. Методы определения цитокинов 44
1.3.4. Методы определения антиген-специфических Т-клеток, продуцирующих цитокины
1.3.5. Методы количественного определения антиген-специфических Т-клеток
Заключение по обзору литературы 53
2. Материалы и методы 54
2.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред, реактивы, реагенты и прочие материалы
2.2. Плазмиды 55
2.3. Бактерии 55
2.4. Культура клеток 2.5. Растворы 55
2.6. Методы 2.6.1. Проектирование искусственных полиэпитопных Т-клеточных 58 ВИЧ-1 иммуногенов TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3
2.6.2. Синтез генов и конструирование рекомбинантных плазмид 58
2.6.3. Трансформация клеток Е. coli BL21 плазмидными ДНК 59
2.6.4. Наработка препаративного количества рекомбинантных 59 плазмидных ДНК
2.6.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК 60 2.6.5.1 Лизис бактериальных клеток 2.6.5.2. Удаление РНК из раствора плазмидной ДНК 60
2.6.5.3. Осаждение плазмидной ДНК 61
2.6.5.4. Дробное фракционирование плазмидной ДНК 61 этиловым спиртом
2.6.5.5. Очистка плазмидной ДНК от примесей низкомолекулярной РНК 62
2.6.5.6. Измерение концентрации раствора ДНК
2.6.6. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 62
2.6.7. Трансфекция эукариотических клеток сконструированными плазмидами
2.6.8. Электрофорез белков в полиакриламидом геле 63
2.6.9. Вестерн-блот анализ 64
2.6.10. Внутриклеточная детекция полиэпитопных белков TCI-N, 65
TCI-N2 и TCI-N3 с использованием моноклональных антител,
меченых FITC
2.6.11. Иммунизация лабораторных животных сконструированными 66 ДНК-вакцинными конструкциями и сбор образцов для анализа
2.6.12. Исследование ВИЧ-специфического иммунного ответа 66 у мышей линии BALB/c после ДНК-иммунизации
2.6.12.1. Выделение спленоцитов иммунизированных животных 66
2.6.12.2. Стимуляция спленоцитов иммунизированных животных 67
2.6.12.3. Внутриклеточное окрашивание цитокинов 67
2.6.13. Определение количества ВИЧ-1 Env- и Gag-специфических 68 CD8+ Т-лимфоцитов у вакцинированных добровольцев с использованием пептид-МНС-пентамеров 2.6.14. Статистическая обработка полученных результатов 70
3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Проектирование искусственных ВИЧ-1 полиэпитопных 73
Т-клеточных иммуногенов TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3
3.1.1. Выбор Т-клеточных эпитопов 73
3.1.2. Дизайн последовательности целевых Т-клеточных иммуногенов 78
3.1.3. Проектирование целевых Т-клеточных иммуногенов
3.1.4. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих полиэпитопные Т-клеточные иммуногены
3.1.5. Наработка препаративного количества ДНК рекомбинантных плазмид
3.2. Изучение экспрессии целевых генов в клетках 293Т, трансфицированных рекомбинантными плазмидами
3.2.1. SDS-PAGE и вестерн-блот анализ 85
3.2.2. Внутриклеточная детекция полиэпитопных белков 86 TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3 с использованием
моноклональных антител 29F2, меченых FITC
3.3. Исследование иммуногенности ДНК-вакцинных конструкций, 88
кодирующих полиэпитопные иммуногены TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3
3.3.1. Иммунизация лабораторных животных сконструированными 88
ДНК-вакцинами и сбор образцов
3.3.1.1. Выбор параметров для исследования ВИЧ-специфического 89 иммунного ответа, индуцированного вакцинацией
3.3.1.2. Выбор метода и протокола для исследования 90 ВИЧ-специфического иммунного ответа, индуцированного вакцинацией
3.3.3. Изучение способности искусственных полиэпитопных 96 иммуногенов TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3 стимулировать ВИЧ-специфические ответы CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов
3.3.4. Исследование влияния дополнительных сигнальных 99 последовательностей в структуре полиэпитопных иммуногенов на
индукцию ВИЧ-специфических ответов CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов
3.3.5. Выбор наиболее эффективной ДНК-вакцинной конструкции, 100
стимулирующей наибольший уровень ВИЧ-специфического
CD4+ и CD 8+ Т-клеточного ответа
3.3.5.1. Исследование ВИЧ-специфического CD4+ Т-клеточного ответа в результате иммунизации ДНК-вакцинными конструкциями, кодирующими полиэпитопные иммуногены TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3
3.3.5.2. Исследование ВИЧ-специфического CD8+ Т-клеточного ответа в результате иммунизации ДНК-вакцинными конструкциями, кодирующими полиэпитопные иммуногены TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3
3.3.6. Можно ли путем оптимизации структуры иммуногена получить вакцину, которая по иммуногенности будет превосходить вакцины, полученные на основе нативных антигенов?
3.4. Исследование формирования ВИЧ-специфических 108
CD8+ Т-лимфоцитов у добровольцев, иммунизированных вакциной «КомбиВИЧвак»
3.4.1. Описание вакцины и клинических испытаний 109
3.4.2. Определение Env- и Gag-специфических CD8+ Т-лимфоцитов у HLA-A 0201 -позитивных добровольцев, вакцинированных «КомбиВИЧвак»
Заключение 117
Выводы 120
Список литературы
