Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 7
Глава 1. Семейство Sm и Sm-подобных белков 7
Глава 2. Пространственная структура Sm/Sm-подобных белков 8
2.1. Первичная структура Sm-подобных белков 9
2.2. Четвертичная структура Sm/Sm-подобных белков 12
2.2.1. Белок AF-Sm2 может быть гексамером и гептамером 16
2.2.2. Октамерный белок Lsm3 21
2.2.3. Бактериальные белки Hfq – гексамеры 22
2.2.4. Некоторые Sm-подобные белки эукариот существуют в виде мономеров 23
2.3. Динамика четвертичной структуры Sm/Sm-подобных белков 24
2.4. Образование фибрилл 27
Глава 3. Функции Hfq в клетке 32
3.1. Hfq имеет две РНК-связывающие поверхности 33
3.2. Взаимодействие Hfq с малыми регуляторными и матричными РНК 41
3.3. Взаимодействие Hfq с белками 49
3.4. Функции Hfq в нуклеоиде 50
ЧАСТЬ II. Методическая 52
Глава 4. Материалы и методы 52
4.1. Методы генной инженерии и микробиологии 52
4.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле 52
4.1.2. Получение плазмид с необходимыми мутациями 52
4.1.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
4.1.4. Очистка фрагментов ДНК 54
4.1.5. Получение компетентных клеток 54
4.1.6. Трансформация клеток 54
4.1.7. Выделение плазмидной ДНК 55
4.2. Биохимические методы при работе с белками 55
4.2.1. Экспрессия генов hfq дикого типа и его мутантных форм 55
4.2.2. Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм 55
4.2.3. Тепловая коагуляция термолабильных белков 55
4.2.4. Гидрофобная хроматография 56
4.2.5. Ионообменная хроматография 56
4.2.6. Аналитическая гель-фильтрация 56
4.2.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН 57
4.2.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях 57
4.2.9. Кристаллизация белков Hfq 58
4.3. Определение стабильности белка Hfq дикого типа и его мутантных форм 58
4.3.1. Измерение спектров кругового дихроизма 58
4.3.2. Термофлуоресцентный анализ 59
4.3.3. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия 60
4.4. Определение и уточнение структур белков и комплексов белка Hfq с
нуклеотидами 61
ЧАСТЬ III. Результаты и их обсуждение 62
Глава 1. Получение генетических конструкций мутантных белков Hfq 62
Глава 2. Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм 62
Глава 3. Влияние произведенных замен на стабильность и олигомерное состояние
белка Hfq 65
3.1. Влияние произведенных замен на стабильность вторичной структуры
белка Hfq 65
3.2. Влияние произведенных замен на экспонированность гидрофобных областей на поверхности белка 68
3.3. Влияние произведенных замен на стабильность мутантных белков 70
3.4. Влияние произведенных замен на олигомерное состояние белка Hfq 73
Глава 4. Кристаллизация мутантных белков 78
4.1. Использование метода термофлуоресцентного анализа для поиска условий кристаллизации мутантных форм белка Y55A, D40A и YKHA/RGDT PaeHfq. 80
Глава 5. Определение структур белков Hfq 83
Глава 6. STRONG Анализ полученных данных по стабильности и кристаллических структур
белков Hfq STRONG 84
Глава 7. Проверка ATФазной активности белка 89
Глава 8. Кристаллизация препаратов Hfq с рибонуклезидтрифосфатами 91
Глава 9. Определение структур полученных комплексов 93
9.1. Структура комплекса Hfq c ATФ и с его нерасщепляемым аналогом ADPNP 95
9.2. Структура комплекса Hfq c ЦTФ 97
9.3. Структура комплекса Hfq c УTФ 100
9.4. Hfq не формирует устойчивых комплексов с ГТФ 101
Глава 10. Сравнение полученных нами структур комплексов Hfq- рибонуклезидтрифосфатов с известными структурами комплексов HfqолигоРНК 104
Глава 11. Модель связывания белка Hfq с РНК 107
Заключение 111
Выводы 112
Список использованной литературы 113
