Введение
Исследования структуры L12/P-выступа рибосомы 9
1. Компоненты L12/Р-выступа рибосомы 13
1.1. Бактериальные белки L10, L11 и L12 13
1.2. Белки эукариотического и архейного P-выступа
2. Взаимозаменяемость бокового выступа бактерий, архей и эукариот 36
3. Кристаллографические исследования L12/P-выступа в составе рибосом 38
Заключение 40
Экспериментальная часть 42
1. Материалы 42
1.1. Химические материалы 42
1.1.1. Реактивы и ферменты 42
1.1.2. Буферы 42
1.1.3. Питательные среды 43
1.2. Биологические материалы 43
1.2.1. Бактериальные штаммы 43
1.2.2. Плазмиды
1.3. Принадлежности 43
1.4. Приборы 44
2. Методы 44
2.1. Методы генной инженерии 44
2.1.1. Полимеразная цепная реакция 44
2.1.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 45
2.1.3. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции 46
2.1.4. Очистка фрагментов ДНК 46
2.1.5. Лигирование фрагментов ДНК 46
2.1.6. Получение компетентных клеток E. coli 46
2.1.7. Трансформация компетентных клеток E. coli лигазной смесью («Бело-голубой тест») 47
2.1.8. Анализ клонов клеток методом ПЦР 47
2.1.9. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК 48
2.1.10. Выделение плазмидной ДНК 48
2.1.11. Рестрикция и очистка плазмидной ДНК для транскрипции 48
2.1.12. Фенольная депротеинизация нуклеиновых кислот 49
2.1.13. Экспрессия рекомбинантных генов белков MjaP0NTF, MjaL11 49
2.1.14. Экспрессия гена белка MjaL11 для получения селенометионинового производного белка 50
2.2. Биохимические методы при работе с белками 50
2.2.1. Выделение белков MjaP0NTF, MjaL11 и Se-Met MjaL11 50
2.2.2. Хроматографическая очистка белка MjaP0NTF 50
2.2.3. Хроматографическая очистка белка MjaL11 и его селенометионинового производного 51
2.2.4. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 52
2.2.5. Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях рН 4.5 53
2.3. Биохимические методы при работе с РНК 53
2.3.1. Получение специфических фрагментов рРНК 53
2.3.2. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях с мочевиной 54
2.3.3. Электрофорез белка, РНК, РНК-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях 54
2.3.4. Получение РНК-белковых комплексов 55
2.3.4.1. Образование комплексов MjaP0NTF с фрагментами 23S рРНК разной длины 2.3.4.2. Образование комплекса MjaP0NTF-MjaL11-23SрРНК(74) 55
2.3.4.3. Образование комплекса MjaP0NTF-MjaL11-23SрРНК(74)-тиострептон
2.4. Кристаллизация белка и РНК-белковых комплексов 56
2.5. Кристаллографичекие методы
2.5.1. Съемка и обработка дифракционных данных 57
2.5.2. Анализ содержания ячейки 57
2.5.3. Определение и уточнение структур
2.5.3.1. Переуточнение структуры P0(P1NTD)6 из P. horikoshii 60
2.5.3.2. Определение и уточнение структуры MjaL11 60
2.5.3.3. Определение и уточнение структуры MjaP0NTF-23SрРНК(74) 62
2.5.3.4. Определение и уточнение структуры MjaP0NTF-MjaL11-23SрРНК(74) 63
2.5.3.5. Определение и уточнение структуры MjaP0NTF-MjaL11-23SрРНК(74)-тиострептон 65
Результаты и обсуждение 66
1. Кристаллизация и определение структур компонентов P-выступа архейной рибосомы. 66
1.1. Изолированный рибосомный белок L11 из археи M. jannaschii 66
1.2. Фрагмент белка P0, P0NTF, в комплексе со специфичным фрагментом 23S рРНК 70
1.3. Тройной комплекс MjaP0NTF-MjaL11-23SрРНК(74) 78
1.4. Комплекс MjaP0NTF-MjaL11-23SрРНК(74) с тиострептоном 79
1.5. Переуточнение структуры комплекса P0(P1NTD)6 из археи P. horicoshii 81
2. Анализ структур компонентов архейного рибосомного P-выступа 83
2.1. Структура изолированного рибосомного белка MjaL11 83
2.2. Анализ структур комплексов MjaP0NTF со специфичным фрагментом 23S рРНК в отсутствии и присутствии MjaL11 86
2.3. Взаимодействие белков архейного рибосомного P-выступа с 23S рРНК 89
2.4. Взаимодействие архейного рибосомного P-выступа с антибиотиком тиострептоном 2.5. Подвижность компонентов основания P-выступа архейной рибосомы 97
Основные результаты и выводы 102
Список литературы 103
