Введение
1. Общая характеристика работы 7
1.1 Актуальность проблемы 7
1.2 Цели и задачи работы 9
1.3 Научная новизна работы 9
1.4 Практическая значимость 10
1.5 Апробация работы 10
2. Обзор литературы 12
2.1 Роль генов stellate в сперматогенезе drosophila melanogaster 12
2.1.1 Система генов crystal-Stellate 14
2.1.2 Эволюция системы генов crystal-Stellate 16
2.1.3 Гены Stellate — основная мишень piPHK-зависимого сайленсинга в терминальных тканях самцов Drosophila теlanogaster 21
2.1.4 Белок Stellate, партнёры и посттрансляционные модификации 24
2.2 Транскрипционная регуляция у эукариот 32
2.2.1 Области контроля транскрипции. Белки регуляторы транскрипции 32
2.2.2 Способы инициации транскрипции 34
2.2.3 Основные регуляторные элементы корового промотора 36
2.2.3.1 ТАТА-бокс 36
2.2.3.2 TFIIB recognition element (BRE). BREu uBREd 38
2.2.3.3. Инициатор (Inr) 39
2.2.3.4 Downstream Promoter Element (DPE) 40
2.2.3.5 Motif ten element (MTE) 41
2.2.3.6 Трехчастная организация послестартового корового промотора DCP (downstream core promoter) 43
2.2.3.7 Downstream core element (DCE) 44
2.2.3.8 Элементы, функционирующие независимо от ТАТА-бокса или инициатора (ХСРЕ1, XCPE2,MED-1) 44
2.2.3.9 ТСТмотив (полипиримидиновый инициатор) 45
2.2.3.10 CpG островки 47
2.2.4 Проксимальные промоторные элементы 48
Е-бокс (enhancer box). Суперсемейство транскрипционных факторов ЪНЬН 49
2.2.5 Дистальные регуляторные элементы 52
2.2.6 Модели транскрипционной регуляции с помощью регуляторных элементов минимального промотора 53
2.2.7 Семенник-специфичные промоторы Drosophila 55
2.2.8 Особенности транскрипции генов при сперматогенезе у Drosophila 59
Заключение 61
3. Материалы и методы 62
3.1 Биоинформатические методы 62
3.1.1 Поиск участков связывания транскрипционных факторов 62
3.1.2 Оценка дивергенции промоторов 62
3.2 Биологические материалы 62
3.3 Линии Drosophila и генетические скрещивания 63
Мобилизация Р-элементов Stel34-lacZuStel34-E2M-lacZ 64
3.4 Стандартные молекулярно-биологические методы 64
3.5 Создание трансгенных конструкций Stel34-E123M-lacZ и Stel34-E2M-lacZ. 64
3.6 Трансформация эмбрионов Drosophila 65
3.6.1 Подготовка и тренировка стада 65
3.6.2 Сбор эмбрионов и инъекции 66
3.6.3 Сбор эмбрионов после инъекций 67
3.7 Анализ активности р-галактозидазы в семенниках трансгенных мух 67
3.8 Выделение ядерных экстрактов 69
3.9 Гель-шифт 70
3.9.1 Зонды 70
3.9.2 Получение двуцепочечных зондов 71
3.9.3 Кинирование и очистка зондов 71
3.9.4 Гель-шифт и супер-шифт 72
3.10 Детекция транскриптов dUSF 73
3.11 Получение антител к белку dUSF 74
3.11.1 Создание конструкций pQE30 -fUSF и pQE30 USF 74
3.11.2 Экспрессия конструкций pQE30 -fUSF иpQE30 USF и очистка рекомбинантных белков 76
3.11.3 Иммунизация мышей рекомбинантными белками 6His-fUSF и 6HisUSF и получение антисывороток 77
3.12 Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA) 77
3.13 Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ 78
3.14 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов целых семенников и конфокальная микроскопия 79
4. Результаты 81
4.1 Идентификация ис-регуляторных участков в промоторе генов Stellate 81
4.2 Идентификация фактора, связывающего Е-боксы в промоторе гетерохроматиновых генов Stellate 92
4.3 Оценка значимости ис-регуляторных элементов в составе промотора
гетерохроматиновых генов Stellate in vivo 106 4.4 Детальное картирование промотора гетерохроматиновых генов Stellate 109
4.5 Дивергенция в промоторной области генов pNACtes 112
4.6 Репрессия активности трансгенов в Х-хромосоме 116
5. Обсуждение 118
6. Выводы 125
7. Список цитируемой литературы 126
8. Благодарности
