Введение
Обзор литературы 6
1.1 Процессинг и деградация мРНК в клетках млекопитающих 6
1.1.1 Альтернативный сплайсинг 6
1.1.2 Нонсенс-зависимая деградация мРНК 7
1.2 Функциональная организация процесса NMD 8
1.2.1 Участвующие в процессе NMD белки 8
1.2.2 Механизм распознавания стоп-кодонов какПСК 13
1.2.3 Регуляция активности NMD 16
1.3 Физиологическое значение процесса NMD, а также отдельных факторов NMD в норме и
патологии 17
1.3.1 Регуляция представленности мРНК селенопротеинов 18
1.3.2 NMD и ответ клеток на стресс 18
1.3.3 Регуляция представленности транскриптов, возникающих путем альтернативного сплайсинга 19
1.3.4 NMD и перестройки генов антител 21
1.3.5 Участие отдельных факторов NMD в различных процессах физиологии клетки 22
1.3.6 NMD и фенотипическое проявление генетических заболеваний 23
1.4 Существующие подходы для исследования процессинга и деградации мРНК 31
1.4.1 Основные методы, применяемые для исследования процесса сплайсинга 31
1.4.2 Основные методы, применяемые для исследования процесса NMD 32
Цели и задачи 35
Материалы и методы 36
2.1 Материалы 36
2.1.1 Вектора 36
2.1.2 Реактивы и расходные материалы для клонирования 36
2.1.3 Оборудование и программное обеспечение для клонирования 37
2.1.4 Эукариотические клеточные линии, культуральные среды и расходные материалы 37
2.1.5 Оборудование для работы с клеточными линиями и анализа флуоресцентных сигналов38
2.1.6 Реагенты и оборудование для Вестерн-блоттинга 38
2.1.7 Реагенты и оборудование для выделения РНК, синтеза кДНК и количественной ПНР...39
2.2 Методы 40 2.2.1 Получение генетических конструкций 40
2.2.2 Культивирование и трансфекция клеточных линий НЕК и HeLa 44
2.2.3 Культивирование и трансфекция первичных клеток MEF и ES 44
2.2.4 Флуоресцентная микроскопия 45
2.2.5 Проточная цитометрия 46
2.2.6 Вестерн-блоттинг 46
2.2.7 Нокаут эндогенного UPF1 с помощью кшРНК в культуре клеток 47
2.2.8 Выделение РНК, получение кДНК и количественная ОТ-ПЦР в реальном времени 48
2.2.9 Обработка клеточных линий известными ингибиторами NMD и оценка стабильности РНК сенсора 50
2.2.10 Работа с трансгенными эмбрионамиXenopus laevis 51
Результаты и обсуждение 53
3.1 Использование пары флуоресцентных белков TagGFP2 и Katushka для мониторинга процессинга РНК in vivo 53
3.2 Разработка генетически кодируемых репортеров активности NMD
3.2.1 Разработка генетически кодируемого репортера активности опосредуемого сплайсингом NMD 58
3.2.2 Разработка генетически кодируемого репортера активности независимого от сплайсинга NMD 62
3.3 NMD в культуре клеток 64
3.3.1 Выбор контрольной репортерной конструкции для зависимого от сплайсинга NMD 64
3.3.2 Тестирование репортера для зависимого от сплайсинга NMD в линии клеток млекопитающих 65
3.3.3 Оценка способности разработанного репортера зависимого от сплайсинга NMD отслеживать изменения активности NMD в клетках НЕК293Т 70
3.3.4 Применение разработанного репортера для измерения активности зависимого от сплайсинга NMD в различных линиях клеток 76
3.3.5 Тестирование репортера для независимого от сплайсинга NMD в линии клеток млекопитающих 79
3.4 Оценка возможности применения разработанного репортера активности опосредуемого сплайсингом NMD в трансгенных животных на примере эмбрионов шпорцевых лягушек Xenopus laevis 81
3.5 Применение интрона 2 гена Р-глобина человека для усиления экспрессии химерных генов.84
Выводы 86
Заключение 87
Список сокращений 89
Список литературы
