Введение
Литературный обзор
Пектин и пектинметилэстераза: общие сведения 8
Рост листа: sink и source зоны листа 11
Модификация пектина в росте и развитии растения 12
Реакция гена ПМЭ на стрессовое воздействие на растение 14
Метанол растительной клетки: происхождение и метаболизм 17
Эмиссия метанола растением 19
Эмиссия метанола в условиях стресса 21
Летучие органические соединения растений с сигнальной функцией 22
Летучие органические соединения и вирусная инфекция 24
Материалы и методы
Используемые растения 27
Нозерн-блот анализ 27
Измерение метанола в среде 28
Измерение метанола в соке растений 28
Газовая хроматография 28
Подавляющая вычитающая гибридизация 28
Методы биоинформатики и статистического анализа 29
qRT-PCR (количественная ПЦР в реальном времени с предварительным получением кДНК) 29
Плазмиды 30
Обратная транскрипция 33
Определение ферментативной активности ПМЭ 34
Измерение ферментативной активности GUS 34
Детекция флуоресценции GFP 34
Агроинфильтрация растений 35
Тест на связывание белков на мембране в ренатурирующих условиях (overlay assay) 35
Подготовка проб из зон агроинъекции для разделения электрофорезом в ПААГ (полиакриламидном геле) 36
Измерение апертуры устьиц 36
Инокуляция ВТМ 36
Иммунизация мышей 36 Вестерн-блот анализ 37
Выделение тотальной фракции РНК из растений c помощью TRI Reagent 37
Фракционирование листового материала 37
5 -RACE (rapid fmplification of cDNA ends) метод 38
«Прогулка по хромосоме» для изоляции прNCAPP и прПМЭ 38
Получение трансгенных растений прNCAPP-GUS 39
Обработка растений метанолом 39
Результаты и обсуждение 43
ГЛАВА I. Гены, индуцируемые метанолом (ГИМ), в ответе растений на стресс 40
1.1. Синтез метанола при механической травме растения 40
1.2. ГИМ: реакция на механическую травму 44
1.3. ГИМ активируют межклеточный транспорт 52
1.4. Участие ГИМ в вирусной инфекции 56
ГЛАВА II. ГИМ: участие в процессе роста и развития листьев табака 61
11.1. Влияние метаболического метанола на регуляцию ГИМ 61
11.2. Новые ГИМ с дифференциальной экспрессией в sink и source зонах листа 68
ГЛАВА III. Механизм обратной связи в цикле «метанол-NCAPP-ПМЭ-метанол» 78
111.1. Промотор гена NCAPP чувствителен к метанолу 78
111.2. Экспрессия гена ПМЭ зависит от экспрессии гена NCAPP 83
111.3. Уровень транскрипции гена ПМЭ влияет на уровень эмиссии метанола 89
Заключение 92
Выводы 95
Список сокращений 96
Список цитируемой литературы
