Введение
Обзор литературы 11
1. Характеристика бактериофагов 11
1.1 Гигантские phiKZ-подобные бактериофаги 11
1.2 Происхождение различных видов phiKZ-подобных фагов 12
1.3 Геномы phiKZ-подобных бактериофагов 16
1.4 Внутреннее тело 16
2. Биологические свойства палочкообразных вирусов растений (род Hordeivirus) 17
2.1 Жизненный цикл ВШМЯ 18
2.2 Организация генома Hordeivirus и его экспрессия. 19
2.3 Функции белков ВШМЯ. 21
2.4 Функции белков TGB при передвижении локально и от клетки к клетке . 21
2.5 Размножение ВШМЯ. 23
2.6 Межклеточный транспорт ВШМЯ. 24
3. Электронная микроскопия макромолекул . 26
3.1. Получение электронно-микроскопическихизображений макромолекул 27
3.1.1 Подготовка проб 27
3.1.2 Негативное контрастирование изолированных комплексов 28
3.1.3 Крио-ПЭМ изолированных и субклеточных комплексов.
3.2 Взаимодействие электронного пучка с образцом 30
3.3 Формирование изображения
3.3.1 Источники электронов 32
3.3.2 Система линз электроннного микроскопа. 32
3.3.3 Аберрации в электронной микроскопии 33
3.3.4. Передача контраста 35
3.3.5 Контраст, создаваемый тонкими образцами. 36
3.4. Детекция ПЭМ изображений 38
3.5. Обработка ПЭМ изображений 39
3.5.1. Предварительная обработка изображений отдельных частиц 39
3.5.2 Определение ЧКХ. 40
3.5.3 Коррекция ЧКХ на изображении 41
3.5.4 Фазовая коррекция. 41
3.5.5 Коррекция амплитуды. 41
3.5.6 Нормализация изображения 41
3.6. Выравнивание изображений 42
3.6.1. Кросс-корреляционная функция 43
3.6.2 Принципы и стратегии выравнивания 43
3.7 Статистический анализ изображений 44
3.7.1 Метод главных компонент 44
3.7.2. Иерархическая кластеризация
3.8. Определение ориентации 46
3.9 3D-реконструкция 47
3.9.1. Методы реконструкции в реальном пространстве 47
3.9.2 Методы реконструкции в пространстве Фурье 49
3.9.3 Распределение проекций 51
3.10 Оценка качества реконструкции 52
3.10.1 Измерение разрешения 52
3.10.2. Температурный фактор и изменение масштаба амплитуд 53
3.10.3 Источники неоднородности. 53
3.10.4 Методы компьютерной сортировки смешанных структур 54
3.11 Интерпретация 3D карты 55
4. Применение электронной микроскопии макромолекул в биологии 55
4.1 Применение крио-электронной микроскопии для изучения структуры вирусов с различной симметрией. 56
4.2 Применение крио-электронной микроскопии для изучения структуры хвостатых бактериофагов
4.2.1 Структура фага Т4 56
4.2.2 Структура капсида фага phiKZ
4.2.2 Структура хвоста phiKZ. 62
4.2.3 Изучение структуры внутреннего тела 65
4.3 Применение крио-электронной микроскопии для изучения структуры спиральных вирусов 67
4.3.1 Структура вируса табачной мозаики (ВТМ) 67
4.3.2 Механизм сборки/разборки ВТМ 71
4.3.3 Структура ВШМЯ 73
Цели и задачи работы 77
Материалы и методы исследования 78
1. Очистка и выделение вируса ВШМЯ 78
2. Выделение бактериофагов 79
3. Негативное контрастирование 79
4. Крио-микроскопия 80
5. Обработка изображений.
5.1. Икосаэдрическая реконструкция капсидов фагов EL и Lin68 80
5.2. Обработка изображений ВШМЯ 81
5.3. Получение картин электронно-лучевого повреждения (CBP) внутреннего тела в капсидах бактериофагов 88
Результаты 89
1. Морфология и трехмерная организация бактериофагов EL и Lin68 89
2. Организация генома внутри капсидов гигантских бактериофагов 91
3. Структура вирионов ВШМЯ по данным крио-ПЭМ 3.1 Структура ВШМЯ дикого типа 93
3.2 Структура рекомбинантного ВШМЯ 95
4. Характер сворачивания полипептидной цепи БО ВШМЯ 96
5. Контакты между субъединицами БО ВШМЯ 100
5.1 Латеральный контакт на внешней поверхности вириона 101
5.2 Аксиальные контакты
6. Взаимодействие БО ВШМЯ с РНК 104
7. Возможный механизм диссоциации капсида ВШМЯ 107
Обсуждение результатов 109
Выводы 113
Список цитируемой литературы
