Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Ретиналь содержащие белки галофильных архебактерий 8
1.1.1. Функции и биологическое место 8
1.1.2. Общая характеристика и свойства ретиналевых белков Я salinarum 9
1.2. Бактериородопсин . 11
1.2.1. Исторический обзор и общая характеристика 11
1.2.2. Фотоцикл бактериородопсина 12
1.2.3. Стабилизация промежуточных состояний 16
1.2.4. Кристаллографические структуры основного и промежуточных состояний BR 17
1.2.5. Модели транспорта протона 21
1.3. Сенсорный родопсин II из Natronobacteriumpharaonis 22
1.3.1. Структура и фотоцикл SRII ,.„ ,...22
1.3.2. Взаимодействие с трансдьюсерным белком и передача сигнала 24
1.4. Кристаллизация мембранных белков в липидной кубической фазе 26
1.4.1. Особенности кристаллизации мембранных белков 26
1.4.2. Липидная кубическая фаза 27
1.4.3. Методика кристаллизации в липидной кубической фазе 29
1.4.4. Механизм кристаллизации в кубической фазе 29
1.5. Мероэдрическое двойникование белковых кристаллов 30
1.6. Текущие проблемы и противоречия в исследовании BR и SRI1 32
1.7. Заключение 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Материалы для кристаллизации 34
2.1.1. Моноглицериды 34
2.1.2. Октилглюкозид 34
2.2. Получение и очистка бактериородопсина 35
2.2.1. Культивация бактерий 35
2.2.2. Выделение ПМ 35
2.2.3. Солюбилизация BR 36
2.2.4. Определение концентрации и качества BR 37
2.2.5. Определение концентрации детергента 37
2.3. Кристаллизация бактериородопсина в кубической фазе 39
2.4. Расщепление двойниковых кристаллов 40
2.5. Дифракция нейтронов и определение симметрии и постоянной решетки кубической фазы 40
2.6. Установки для малоугловой дифракции и рассеяния нейтронов : ЮМО и Діб.42
2.7. Установки для рентгеновской кристаллографии белков 43
2.8. Определение фактора двойникования кристаллов 44
2.9. Принципы измерения спектроскопических данных с разрешением по времени 46
2.10. Инфракрасная Фурье-спектроскопия. Принцип пошагового сканирования 47
2.11. Установка для спектроскопии кристаллов 50
2.11.1. Спектроскопия в видимом диапазоне: статическая и с временным разрешением 50
2.11.2. Спектроскопия в ИК диапазоне 53
2.12. Определение кинетики фотоцикла: выбор модели и обработка данных 54
ГЛАВА 3. Кристаллизация бактериородоисина; исследование механизма и оптимизация условий кристаллизации
3.1. Введение 58
3.2. Изучение эволюции параметров липидной фазы в процессе кристаллизации с помощью дифракции нейтронов 59
3.2.1, Идентификация фазы 59
3.2.2. Медленная кинетика 60
3.23. Быстрая кинетика 62
3.3. Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения раствор/липид 63
3.4. Влияние моноглицерида: кристаллизация в МО, MB и MP 66
3.5. Влияние октилглюкозида 67
3.6. Влияние концентрации белка и рН 68
3.7. Обсуждение 68
3.8. Двойникование и скорость роста кристаллов 70
3.9. Расщепление двойниковых кристаллов на одиночные 71
3.10. Структура двойниковых кристаллов и модель возникновения двойникования 74
3.11. Основные результаты и выводы 75
ГЛАВА 4. Характеристика кристаллов спектроскопическими методами и фиксация промежуточных состояний в кристалле для рентгеноструктуриого анализа
4.1. Введение 78
4.2. Спектроскопия кристаллов BR 78
4.2.1. Характеристика основного состояния в кристалле 78
4.2.2. Характеристика фотоцикла BR в кристалле с помощью видимой и ИК-Фурье спектроскопии с разрешением по времени 80
4.3. Фиксация и характеристика промежуточных низкотемпературных состояний в кристаллах BR 85
4.3.1. К состояние 85
4.3.2. L и М состояния 86
4.3.3. N состояние 89
4.4. Обсуждение 91
4.5. Рентгеноструктурные данные основного и промежуточных состояний кристаллов BR 94
4.6. Спектроскопия кристаллов SRII в комплексе с Htrll 95
4.6.1. Спектр поглощения и фотоцикл 95
4.6.2. Фиксация и характеристика К состояния 97
4.6.3. Фиксация и характеристика М состояния 98
4.7. Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса SRII 102
4.8. Основные результаты 104
4.9. Основные выводы 105
Основные выводы работы 107
Библиографический список используемой литературы 109
