Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы.
1.1. Бактериологические особенности Н. pylori
1.2. Роль белково-антигенных комплексов в патогенности Н. pylori. 12
1.3. Проблемы диагностики Н. pylori. 19
1.4. Микробиологические и серологические методы диагностики Н. pylon.
1.5. Методы получения моноклональных антител и их практическое использование 30
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Лабораторные животные 43
2.2. Бактериальные штаммы и антигены 43
2.3. Приготовление элективной питательной среды для выделения и культивирования Н. pylori (СЭХ) и её экспериментальная оценка 43
2.4. Культивирование штаммов Н. pylori 45
2.5. Клеточные линии позвоночных 48
2.6. Оборудование и реактивы, схема этапов работы 48
2.7. Получение гибридом 53
2.7.1 Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки 53
2.7.2. Гибридизация клеток 53
2.7.3. Клонирование гибридом 54
2.7.4. Культивирование гибридом in vitro и in vivo 54
2.7.5. Криоконсервирование гибридом 55
2.8 Метод очистки иммуноглобулинов 56
2.9. Выделение и фракционирование белков Н. pylori. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 56
2.9.1. Подготовка и проведение электрофореза 56
2.9.2. Визуализация белковых фракций методом окрашивания геля Coomassie brilliant blue R250 58
2.10. Иммуноферментные методы 59
2.10.1. Твердофазный иммуноферментный анализ 59
2.10.2. Иммуноферментный анализ дот-блот 60
2.10.3. Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител 61
2.10.4. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони 62
2.10.5. Конкурентный иммуноферментный анализ 64
2.11. Иммуноблоттинг 66
2.11.1. Электроперенос фракционированных белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану 67
2.11.2. Визуализация белковых фракций на фильтре 68
2.11.3. Проведение иммуноблоттинга 68
2.12. Характеристика белкового антигена методом спектрофотометрии 69
2.12.1. Элюирование белкового антигена — 69
2.12.2. Определение концентрации белка по Лоури 69
2.12.3. Исследование спектров поглощения и собственной флуоресценции белка препарата. 69
2.13. Денситометрический метод обработки результатов гель-электрофореза и используемое програмное обеспечение 71
2.14. Методы статистической обработки результатов исследования 72
Глава 3. CLASS Результаты исследования CLASS 73
3.1. Результаты культивирования бактериальных штаммов Н. pylori и иммунизации лабораторных животных 73
3.2. Исследование и оценка ростовых и элективных свойств среды (СЭХ)
-3-для выделения и культивирования Н. pylori. Характеристика полученных колоний Н. pylon.
3.3. Иммунизация 74
3.4. Получение и первичный скрининг гибридом-продуцентов МКА к белкам Н. pylori
3.5. Оценка специфической активности МКА в серолоических методах 83
3.6. Определение эпитопной направленности МКА к Н. pylori 86
3.7. Определение класса полученных иммуногобулинов 88
3.8. Получение препаративных количеств МКА, их очистка 88
3.9. Фракционирование и построение белкового профиля Н. pylori 89
3.10. Денситометрическое исследование белковых фракций Н. pylori 95
3.11. Сравнительное исследование белковых фракций Н. pylori методом иммуноблоттинга . 103
3.12. Оценка термолабильности белкового антигена Н. pylori, выявляемого МКА гибридомы В10 108
3.13. УФ спектры поглощения и флуоресценции белка. 109
3.14. Определение небелковых компонентов белковых фракций. 113
3.15. Оценка возможности использования полученных МКА в диагностике Н. pylori - инфекции. 114
3.16. Сравнительный анализ чувствительности иммунохимических методов на основе МКА и поликлональных сывороток. 117
Обсуждение результатов исследования 120
Выводы 139
Список использованной литературы 140
