Введение
I. Обзор литературы. 5
1. Транспорт веществ через бактериальную мембрану. 5
1.1. Общая характеристика транспортных белков. Типы и классификация, 5
1.2. Белки множественной лекарственной устойчивости и их регуляция 13
1.3. Транспортеры аминокислот у разных организмов. .21
1.3.1. Экспортеры аминокислот у Corynebacterium glutatnicum 24
1.3.2. Импортеры аминокислоту Corynebacterium glutatnicum ЗО
1.3.3. Экспортеры аминокислот у Escherichia coli ЗО
1.3.4. Импортеры аминокислот у Escherichia coli 37
1.3.5. Системы устойчивости к низким рН у Ecoli. 41
2. Общие принципы регуляции генной экспрессии у прокариот. Глобальные и локальные регуляторы .42
2,1. Глобальный регулятор Lrp. 46
2.1.1. Строение белка Lrp 47
2.1.2. Регуляция экспрессии lrp, 48
2.1.3. Фенотип мутантов. 50
2.1.4. Сайты связывания Lrp. Влияние экзогенных аминокислот 51
2.1.5. Гены, экспрессию которых регулирует Lrp. 54
2.1.6. Взаимодействие с другими факторами 59
2.1.7. Семейство AsnC-Lrp 61
3. Заключение. 63
II. Материалы и методы. 64
1. Бактериальные штаммы, ростовые среды, плазмиды и фаги 64
2. Проведение PCR 67
3. Клонирование генов, кодирующих белки семейства RhtB 67
4. Определение Минимальных Ингабирующих Концентраций (МИК) 68
5. Интеграция rcimyeaS под Р-я^,о промотором в хромосому Ecoli, 69
6. Проведение ферментации 69
7. Вьщеление, очистка ДНК, клонирование, трансформация и трансдукция 72
8. Конструирование трансляционных слияний беспромоторного гена \асТ и регуляторных областей генов rhtB, rhtC,yeaS nyahN 74
9. Определение уровня экспрессии генов. .75
10. Инактивация генов в хромосоме E.colt 76
11. Проведение primer extension 77
III. Результаты и обсуждение 78
1. Клонирование генов yfiK, yggA и yahN, кодирующих белки - члены семейства RhtB, и изучение влияния их сверхэкспрессии на устойчивость клеток Escherichia colt к аминокислотам и их аналогам, а также на накопление аминокислот клетками соответствующих штаммов-продуцентов . 78
2. Исследование гена yeaSr 84
2.1. Компьютерный анализ белка YeaS по предсказанной аминокислотной последовательности 84
2.2. Влияние амплификации гена yeaS на устойчивость накопление аминокислот модельными штаммами-продуцентами E.coli .85
2.3. Влияние сверхэкспрессии гена yeaS иа накопление аминокислот модельными штаммами-продуцентами E.coli 88
2.4. Влияние разобщителя на накопление лейцина клетками E.coli, .91
2.5. Индукция экспрессии renayeaS аминокислотами 92
3. Исследование регуляции генов, кодирующих белки семейства RhtB, на примере генов rhtB,rhtC, yeaS и yahN 94
3.1. Исследование регуляторной области rcimyeaS .94
3.2. Компьютерный анализ регуляторных областей генов, кодирующих белки семейства RhtB .95
3.3. Экспрессия генов, кодирующих белки семейства RhtB, зависит от фазы роста культуры и состава среды культивирования, 96
3.4. Экспрессия генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN практически не зависит от а!-субъединицы РНК-полимеразы и регулируется глобальным регулятором Lrp 97
3.5. Влияние экзогенных аминокислот на уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB 101
3.6. Влияние физиологических стрессов на уровень экспрессии генов rhtB,rhtCtyeaS\iyahN. 106
3.7. Уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB, не зависит от OmpR, Crp, Fis, MarR, AcrR, RelA и SpoT Ill
4.8. Уровень экспрессии гена еа^не регулируется продуктом тепйуеаТ 112
IV. Заключение 118
V. Выводы 120
VI. Список литературы
