Введение
II. Обзор литературы 9
1.QS системы luxi-luxr тип а грамотрицательных бактерий 9
1. 1Функционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio jischeiі . 9
1.2 АГЛ и функионирование Luxl—подобных белков 12
1.3 Функционирование LuxR-подобных белков . 13
2. QS Системы грамположительных бактерий с участием аи пептидной природы 15
3.QS Системы, использующие АИ-2 V. 18
4. Обобщение данных о наиболее изученных синтазах аутоиндукторов, участвующих в синтезе агл и аи-2 : . 22
5. QS системы бактерий рода pseudomonas 23
5.1. QS система Pi aeruginosa 23
5.1.1 LasI-LasR и Rhll-RhlR системы регуляции 23
5.1.2 Регуляция QS системы P. aeruginosa дополнительными факторами 27
5.2 QS системы других видов Pseudomonas . 34
5.2.1 Pseudomonas aureofaciens /Pseudomonas chlororaphis 34
5.2.2. Pseudomonasfluorescens 36
5.2.3 Pseudomonas putida 37
5.2A Pseudomonas syringae 38
6. QS система бактерий комплекса bvrkholderia cepacia 39
. Материалы и методы 43
1. Среды и условия культивирования 43
2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 43
3. Определение продукции АГЛ 48
4. Экстракция АГЛ из супернатантов и проведение идентификации АГЛ в культуралъных экстрактах
: 48
5. Методы работы с ДНК. 50
6. Транспозонный мутагенез и определение локализации инсерции минитранспозона. 52
7. Пласпозонный мутагенез и определение места инсерции пласпозона. 53
8. Идентификация генов с помощью ПЦР 54
9. Клонирование генов 55
10. Получение инсерционных мутантов P. chlororaphis 449 методом замены генов 57
П. Определение экспрессии гена у/г в клеточных лизатах 59
12. Анализ ферментативных активностей. 60
13. Определение способности клеток бактерий к миграции по поверхности среды (сворминг) 63
14. Определение антагонистической активности 63
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ. 65
А. Изучение quorum sensing регуляции у pseudomonas chlororaphis 65
1. Скрининг штаммов, синтезирующих агл, из коллекции почвенных бактерий 65
2. Характеристика группы бактерий p. chlororapbis 69
2.1 Определение экзопротеазной, хитинолитической, полигалактуроназной и антагонистической активности у штаммов P. chlororaphis 69
2.2 Исследование влияния температуры на синтез АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеазную активность у штаммов P. chlororaphis . 72
2.3 Идентификация с помощью ПЦР генов двух QS систем и генарЫОу штаммов P. chlororaphis 73
3. Quorum sensing системы p. chloroiuph1s449 и изучение их роли в регуляции клеточных процессов .74
3.1 Клонирование и секвенирование геновphzl, csal из P. chlororaphis 449 74
3.1.1 Клонирование генарШ из P. chlororaphis 449 74
3.1.2 Клонирование гена csal из P. chlororaphis 449 75
3.2 Получение мутации в гене csal у P. chlororaphis 449 77
3.3 Исследование влияния мутации в гене csal на свойства P. chlororaphis 449 78
3.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis с мутацией в гене csal 78
3.3.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal. 80
3.3.3 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal. 80
3.3.4 Полигалактуроназная и пектинметилэстеразная активность в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal. 81
3.3.5 Фосфатазная активность в клетках штамма/*, chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal. 81
3.3.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal. 82
3.3.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 и штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal к миграции по поверхности среды (сворминг) 82
3.4 Влияние плахмиды рМЕ6863, содержащей клонированный ген N-ацип-гомосерин лактоназы, на синтез АГЛ и регуляцию клеточных процессов P. chlororaphis 449. 83
4. Исследование взаимодействия двухкомпонентнои системы GACA-GACS с QS системой и ее роли в регуляции клеточных пюцессов у л chlorotbtphls 449 86
4.1 Получение транспозонных мутантов P. chlororaphis 449 с инактивированным геном gacS. 86
4.2 Клонирование и секвенирование части zeuagacS из P. chlororaphis 449 87
4.3 Исследование влияния .мутации в гене gacS на свойства P. chlororaphis 449 88
4.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в генерал!? 88
4.4.1 Активность экзонротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS. 88
4.4.2 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS 89
4.4.3 Полигалактуроназная и пектинметнлэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS 89
4.4.4 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449с мутацией в гене gacS 89
4.4.5 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS. 89
4.4.6 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS к миграции по поверхности среды (сворминг) 90
5. Клонирование, секвенирование и экспрессия гена vfr p. chlororaphis449, изучение его роли в регуляции клеточных процессов 90
5.7 Идентификация, клонирование и секвенирование гена vfr из P. chlororaphis 449. 90
5.2 Анализ аминокислотных последовательностей белков — гомологов Vfr и проведение исследования
экспрессии гена vfr из P. chlororaphis 449 92
5.2.1 Выравнивание последовательностей белков — гомологов Vfr 93
5.2.2 Клонирование гена vfr из P. chlororaphis 449 в экспрессионном векторе рЕХ20Т 94
5.2.3 Комплементация мутации в гене сгр в клетках Е. coli с помощью гена vfr аз P. chlororaphis 449 95
5.3 Получение инсерционногомутанта P. chlororaphis 449 с инактивированным геном vfr 96
5.4 Исследование влияния мутации в гене vfr на свойства P. chlororaphis 449 97
5.4.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 97
5.4.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 97
5.4.3 Липазная активность в клетках штамма-P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
5.4.4 Полигалактуроназная и пектинметнлэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
5.4.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
5.4.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
3.4.1 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr к миграции по поверхности среды (сворминг) 99
6. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ФЕНАЗИНОВОГО ОПЕРОНА P. CHLOROMPHIS 449 и ХАРАКТЕРИСТИКА
МУТАНТНЫХ ШТАММОВ : 102
В. ИЗУЧЕНИЕ QUORUM SENSING СИСТЕМЫ BURKHOLDERIA CEPACIA, РЕГУЛЯЦИИ.ЕЕ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С СИНТЕЗОМ ФАКТОРОВ ПАТОРЕННОСТИ
107
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКЦИИ АГЛ в КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ в. CEPACIA 107
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ В. CEPACIA 108
2.1 Определение с помощью ПЦР генов QS системы CepI/CepR в коллекции штаммов В. cepacia 108
2.2. Изучение продукции потенциальных факторов патогенності!у штаммов В. cepacia 108
2.3 Определение антагонистической активности клинических штаммов В." cepacia по отношению к
P. aeruginosa и S. aureus. 109
3. ИЗУЧЕНИЕ QS СИСТЕМЫ, ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ И РОЛИ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ У В. CEPACIA 370.. 111
3.1 Клонирование генов серій cepR из В. cepacia 370 ///
3.1.1 Клонирование гена сері из В. cepacia 370 111
3.1.2 Клонирование гена cepR из В. серааа370 113
3.2 Получение мутантных штаммов В. cepacia 370 с измененной продукцией АГЛ 115
3.3 Исследование влияния мутаций в генахpps, clpX, Ion на свойства В. cepacia 370 118
3.3.1 Определение продукции АГЛ 118
3.3.2 Определение экзопротеазной и липазной активности 120
3.3.3. Подавление роста фитопатогенного грнба Sclcrotinia sclerotiorum 120
3.3.4 Определение гемолитической активности 121
3.3.5 Определение способности клеток к миграции по поверхности среды (сворминг) 121
V. ОБСУЖДЕНИЕ 122
VI. ВЫВОДЫ 133
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
