Введение
Глава 1. Взаимодействие регуляторных факторов с РНК-полимеразой 8
1.1. Введение 8
1.2. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики 9
1.2.1. Рифамшщин 9
1.2.2. Тагетитоксин 14
1.2.3. Альфа-аманитиы 17
1.2.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина. 20
1.2.5. Стрептолидигин 21
1.2.6. Липиармицин 23
1.2.7. МикроцинД25 25
1.2.8. Ингибиторы серии CBR703 29
1.2.9. Дауномицин и марселломицин 31
1.3. Фаговые транскрипционные факторы, модифицирующие бактериальные РНК-полимеразы 34
1.3.1. Регуляция транскрипции в ходе развития бактериофага Т7 34
1.3.2. Регуляция транскрипции бактериофага X 35
1.3.3. Регуляция транскрипции в процессе развития фага Т4 37
1.3.4. Транскрипция фагаБРО! 45
1.3.5. Nun белок фага НК022.. 46
1.3.6. Белок SSB бактериофага N4 47
1.3.7. Белок р4 фага J29 48
1.3.8. Белок ogr фага Р2 48
1.4. Клеточные регуляторы транскрипции 49
1.4.1. Белковые репрессоры и активаторы инициации транскрипции 49
1.4.2. Небелковые регуляторы транскрипции 53
1.4.3. Топоизомеразы 56
1.4.4. Рибосомные белки, участвующие в транскрипции 58
Глава 2. Материалы и методы 62
2.1. Бактериальные штаммы, ллазмиды и бактериофаги 62
2.2. Бактериальные среды 63
2.3. Полимеразы 63
2.4. Приготовление лизата фага Хр-10 63
2.5. Электрофорез 64
2.6. Компетентные клетки и трансформация бактерий 64
2.7. Приготовление ДНК. 64
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
2.9. Экспрессия субъединиц РНК-полимеразы, частей р-субъедиинцы РНК-полимеразы Е. coli и X.oryzae и белка р7 , 65
2.10. Выделение тел включения гиперпродуцированных субъединиц, частей 0-субъедшшцы РНК-полимеразы Е. coli и X.oryzae и белка р7 66
2.11. Очистка белков из тел включения хроматографией на Ni^-NTA агарозе в денатурирующих условиях 67
2.12. Сборка РНК-полимеразы Е. coli из отдельных субъединиц in vitro 67
2.17. Приготовление РНК-полимеразы из клеток. 68
2.18. Частичная очистка РНК-полимераз содержащих (3- субъедитщу нлазмлдного происхождения 70
2.19. Транскрипция in vitro 70
2.20. Пирофосфоролиз 74
2.21. Получение арестованных в положении +27 элонгационных комплексов .75
2.22. Щелочное расщепление транскрипта 75
2.23. Коиммобйлизация РНК-полимеразы X.oryzae и р7 на Ni-NTA агарозе 76
2.24. Эксперименты по замедлению миграции промоторных фрагментов в нативномПААГ 76
2.25. Разделение белковых комплексов в нативном ПААГ. 77
2.26. Тестирование трансформантов на устойчивость к микроцину J25 in vivo. 77
2.27. Сайт-специфический мутагенез клонированного гена rpoC Exoli 77
2.28. Мечение олигонуклеотидов 78
2.29. КМпС>4 футпринтинг. 79
2.30. Расщепление термолизином микроцина125 79
2.31. Обратнофазная HPLC хроматография микроцина и его производных 79
2.32. Мечение белка р7 80
2.33. Блогтинг и гибридизация 80
Глава 3. Результаты и обсуждение 81
3.1. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы Xanthomonas oryzae белком р7 бактериофага Хр 10 81
3.1.1. Р7 не является анти-сигма фактором 82
3.12. Р7 взаимодействует с N-концевым участком р*-субъединицы 84
3.1.3. Р7 препятствует образованию открытого комплекса РНК-полимеразой X.oryzae 86
3.1.4.р7 подавляет терминацию транскрипции РНК-полимеразой X.oryzae 88
3.1.5. р7 способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрибирующей полимеразы. 90
3.1.6. Р7 участвует в регуляции транскрипции генома фага ХрЮ 98
3.2. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы микроцином J25 105
3.2.1. Открытие и свойства микроцина J25 105
3.2.2. Система отбора устойчивых мутантов 107
3.2.3. Дополнительные мутации устойчивости в консервативном сегменте G. 108
3.2.4. Микрощш J25 специфически подавляет активность РНК-полимераз грам-отрицательных бактерий 112
3.2.5. Эффект мутаций внутри и вокруг консервативного района G на устойчивость к микрощшу J25 113
3.2.6. Замены, приводящие к устойчивости к микропину, есть и в сегменте F. 117
3.2.7. Некоторые мутации устойчивости к стрептолидигану в р - субъединице оказались мутациями устойчивости и к микроцину 118
3.2.8. Микроцин ингабирует присоединение нуклеотида по смешанному типу. 122
3.2.9. Микроцин уменьшает скорость элонгации транскрипции 123
3.2.9. Микроцин уменьшает скорость пирофосфоролиза. 125
3.2.10. Микроцин замедляет впадение тройного элонгационного комплекса в арестованное состояние 126
3.2.11. Микроцин подавляет стимулируемое GreA фактором расщепление транскрипта и не влияет на собственную эндонуклеазную активность РНК-полимеразы 127
3.2.12.Изучение структуры микроцина J25 129
Выводы 135
Список сокращений: 136
Список литературы 137
Список работ, опубликованных автором по теме диссертации 165
