Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Полиамины в Escherichia coli 8
1.1.1. Эффекты полиаминов in vivo и in vitro 8
1.1.2. Полиамины, представленные в Е.coli 11
1.1.3. Влияние полиаминов на адаптацию Е.соН в условиях стрессов 12
1.1.4. Биосинтез полиаминов 15
1.1.5. Катаболизм полиаминов 20
1.1.6. Транспортные системы полиаминов 27
1.2. Ntr-ответЯ. coli 30
1.2.1. Два пути ассимиляция азота в Е.coli 30
1.2.2. GS активность. Механизм регуляции Ntr-ответа 32
1.2.3. Роль глутамина и а-кетоглутарата 33
1.2.4. Вклад GlnK и AmtB в регуляцию Ntr-ответа 35
1.2.5. Особенности а - зависимой транскрипции 36
1.2.6. Последовательности а54-зависимых промоторов и сайтов связывания NRI 39
1.3. PLP-зависимые аминотрансферазы 41
1.3.1. Группы PLP-зависимых аминотрансфераз 42
1.3.2. Инвариантные аминокислотные остатки аминотрансфераз 44
1.3.3. Эволюционные взаимосвязи между PLP - зависимыми ферментами 45
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1 Бактериальные штаммы 48
2.1.1 Получение штамма MG1655ptr+ 48
2.1.2 Получение штаммов MG1655 ygjG и MG1655 ptr+ ygjG 48
2.2 Среды условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток 49
2.3 Эксперименты с рекомбинантной ДНК 50
2.3.1 Генно-инженерные методики 50
2.3.2 Конструированиерекомбинантных плазмид 51
2.4 Определение старта іранскрипвдга мРНК гена ygjG 54
2.5 Выделение и очистка белков 55
2.5.1 Основные методики оценки препаратов белков 55
2.5.2 Выделение препаратов Ht-ORFl и HI-ORF2 55
2.5.3 Выделение нативного препарата YgjG 56
2.5.4 Определение олигомерной структуры нативного YgjG 57
2.6 Измерение энзиматических активностей ..57
2.6.1 Методы измерения энзиматических активностей 57
2.6.2 Определение основных физических и кинетических параметров препаратов ПАТаз 58
2.7 Программы, использованные для компьютерного анализа 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 61
3.1 Идентификация и клонирование гена pat Escherichia coli К12, кодирующего путресцин;а-кетоглутарат аминотрансферазу 61
3.1.1 Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме E.coli К12 61
3.1.2 Амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего структурную последовательность TCHaygfG, в составе мультикопийной плазмиды 63
3.2 Изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы 65
3.2.1 Анализ нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygfG межцистронного района 65
3.2.2 Изучение регуляции экспрессии гена ПАТазы 68
3.2.3 Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы 71
3.2.4 Анализ продуктов трансляции orfl и ог/2 74
3.3 Характеристика каталитической активности YgjG (ПАТазы) E.coli 77
3.3.1 Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG 78
3.3.2 Определение олигомерной структуры ПАТазы Л1, coli 80
3.3.3 Характеристика субстратной специфичности и основных физических и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG 81
3.4 Влияние аллельного состояния гена ygjG на утилизацию путресцина 88
3.5 Поиск гомологов белка YgjG 90
Выводы 95
Список литературы 96
Список используемых сокращений
