Введение
1.Обзор литературы 13
1.1.Характеристика и биологическая роль некоторых стероидных соединений . 13
1.2.Важнейшие базовые стероидные соединения, получаемые микробиологической трансформацие стероидов 19
1.3. Сырье для получения базовых стероидных соединений 23
1.4.Механизм деградации стеринов микроорганизмами 25
1.4.1.Микробиологическое расщепление стероидного ядра 30
1.4.2.Микробиологическое расщепление боковой цепи стеринов . 31
1.5.Взаимодействие микроорганизмов с гидрофобными стероидными субстратами 36
1.5.1.Использование циклодекстринов и их производных в микробиологических трансформациях стероидов . 37
1.5.2.Применение иммобилизованных биокатализаторов 40
1.6.Подбор штамма-трансформатора . 44
1.7.Процесс микробиологического 9-гидроксилирования. 45
1.8.Применение смешанных культур микроорганизмов . 46
2.Материалы и методы 50
2.1.Микроорганизмы и методы их культивирования 50
2.2.Условия проведения микробиологических трансформаций . 52
2.2.1. Проведение процесса трансформации ФС с помощью М. neoaurum .. 52
2.2.2.Проведение процесса трансформации АД с помощью R. erythropolis 53
2.3.Реактивы для выращивания культур и проведения процесса трансформации 54
2.4.Выделение продуктов микробиологической трансформации 54
2.5.Методы анализов, используемые в микробиологических трансформациях 55
2.5.1.Тонкослойная хроматография (ТСХ) 55
2.5.2.Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 55
2.5.3.Протонный магнитный резонанс (ПМР) 56
2.5.4.Определение содержания глюкозы 56
2.5.5.Определение содержание СО2 56
2.6.Метод иммобилизации клеток бактерии R. erythropolis 57
2.7.ПЦР гена 16S рРНК, секвенирование полученных продуктов и анализ последовательностей 16S rРНК. 57
3.Результаты и обсуждение 59
3.1.Микробиологическая трансформация фитостерина (ФС) с помощью М. neoaurum 59
3.1.1.Определение оптимальных условий микробиологической трансформации ФС с помощью M. neoaurum 60
3.1.1.1. Влияние жирности соевой муки на биоконверсию ХС и ФС в андростендион (АД) с помощью М. neoaurum 61
3.1.1.2.Влияние концентрации глюкозы и характера перемешивания культуральной жидкости М. neoaurum на процесс трансформации ФС в АД 63
3.1.1.3Влияние концентрации гидрокарбонатного иона на полноту биоконверсии ФС в АД с помощью М. neoaurum 64
3.1.1.4.Исследование зависимости скорости накопления АД от дозы
посевного материала М. neoaurum . 68
3.1.2.Трансформация ФС с нагрузкой 20 г/л помощью культуры M. neoaurum 70
3.1.3.Трансформация ФС с нагрузкой 30 г/л с помощью культуры M.neoaurum 71
3.1.4.Трансформация ФС культурой M. neoaurum при повышенной нагрузке (50 г/л)
3.2.Микробиологические трансформации стероидов с помощью бактериальной культуры R. erythropolis ВКПМ Ас-1740 74
3.2.1.Идентификация нового штамма R. erythropolis 75
3.2.2.Определение оптимальных условий проведения трансформации AД при нагрузке 4 г/л штаммом с помощью нового штамма R. erythropolis 78
3.2.3.Трансформация AД до 9-ОН-AД культурой R. erythropolis с нагрузкой субстрата 6-20 г/л 81
3.2.4.9-гидроксилирование AД культурой R. erythropolis с нагрузкой субстрата 50 г/л 83 3.2.5.Гидроксилирование стероидов ряда андростана и прегнана культурой R. erythropolis. 83 3.3. Трансформация АД иммобилизованной культурой R. erythropolis 89
3.4.Трансформация ФС в 9-ОН-АД без выделения АД из культуральной жидкости смешанными культурами М. neoaurum и R. erythropolis в присутствии солюбилизатора 92 3.4.1.Трансформация ФС до 9-ОН-АД смешанными культурами М. neoaurum и R. erythropolis без солюбилизатора 93
3.5.Получение нового 9-гидроксилирующего штамма Rhodococcus 94
3.6.Микробиологическая трансформация 3-метилового эфира ХС до 3-метилового эфира ДГЭА культурой М. neoaurum. 96
3.7.Апробация микробиологического метода получения АД с помощью
М. neoaurum и в 9-ОН-АД с помощью R. erythropolis в ферментере 97
Заключение 99
Выводы. 101
Список публикаций по теме диссертации 102
Список используемой литературы
