Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 26
1.1. Особенности эпидемиологической ситуации и характеристика возбудителя на современном этапе развития VII пандемии холеры 26
1.2. Антибиотикорезистентность возбудителя холеры 30
1.3. Экспериментальные подходы к совершенствованию профилактики и этиотропной терапии холеры 34
1.4. Пробиотики, эубиотики (пробиотические микроорганизмы): характеристика, таксономия, классификация 39
1.5. Характеристика биологических свойств пробиотиков 44
1.5.1. Антагонистическая активность: кислотообразование, продукция бактериоцинов, перекиси водорода и другие механизмы реализации 45
1.5.2. Антибиотикорезистентность пробиотических бактерий . 50
1.5.3. Адгезивная активность 52
1.6. Требования к отбору и характеристике предлагаемых производственных штаммов пробиотических микроорганизмов 55
1.7. Классификация препаратов-пробиотиков 57
1.8. Формы применения препаратов-пробиотиков 60
1.9. Прикладные аспекты использования пробиотических микроорганизмов 61
1.9.1. Применение пробиотиков при острых кишечных инфекциях . 63
1.9.2. Применение пробиотиков при дисбактериозах и дисбиозах различного генеза 65
1.10. Перспективы использования пробиотических микроорганизмов при особо опасных мнфекциях 67
ГЛАВА 2. Материалы и методы . 69
2.1. Музейные штаммы штаммы пробиотических бактерий . 69
2.2. Препараты-пробиотики . 70
2.3. Штаммы холерных вибрионов, холерный бактериофаг . 70
2.4. Бактериальные штаммы других родов и видов микроорганизмов 77
2.5.1. Питательные среды для выделения, культивирования, изучения биологических свойств и хранения пробиотиче-ских бактерий 77
2.5.2. Питательные среды для выделения, культивирования и изучения биологических свойств холерных вибрионов 79
2.5.3. Питательные среды для культивирования энтеропатогенных и условно-патогенных бактерий . 80
2.5.4. Питательные среды для определения контаминации пробиотиков посторонней микрофлорой 80
2.6. Методы выделения и идентификации культур, состав ляющих основы пробиотических препаратов . 80
2.7. Методы изучения биологических свойств пробиотиков 82
2.7.1. Изучение антагонистической активности пробиотиков по отношению к холерным вибрионам 82
2.7.2. Изучение адгезивной активности пробиотических бактерий 83
2.7.3. Определение активности кислотообразования пробиотических бактерий 83
2.8. Методы выделения, идентификации и определения фено-
и генотипических характеристик штаммов холерных вибрионов 84
2.9. Экспериментальные модели холеры, использованные при разработке критериев отбора штаммов пробиотических бактерий 85
2.9.1. Модель кроликов-сосунков . 85
2.9.2. Модель изолированных петель кишечника взрослых кроликов . 85
2.10. Методы изучения биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д, отобранного в качестве основы для лабораторно-экспериментальной разработки нового пробиотика «Лактоацид-Р» 87
2.10.1. Изучение фено- и генотипических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 87
2.10.2. Секвенирование ДНК штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 89
2.10.3. Определение лизоцимной активности и продукция перекиси водорода . 90
2.10.4. Изучение чувствительности/устойчивости к антибак териальным препаратам, применяемым для экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры 90
2.10.5. Методика определения антагонистической активности по отношению к энтеропатогенным и условно-патогенным микроорганизмам 90
2.10.6. Изучение устойчивости к желчи, кислой, щелочной среде, NaCl, определение способности к синтезу экзополисахаридов 90
2.10.7. Изучение активации плазминогена клетками штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 91
2.10.8. Определение вирулентности, токсигенности, «острой» и «хронической» токсичности и безвредности штам- 91 ма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д .
2.10.9. Методика изучения возможности приживления штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д в кишечнике белых мышей на фоне антибиотикотерапии 91
2.10.10. Методика изучения влияния приобретенной рифам-
пицинрезистентности на стабильность биологической ак
тивности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д in vivo 92
2.11. Методы определения контаминации посторонней микрофлорой лабораторно-экспериментальных серий нового про-биотика «Лактоацид-Р» на основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 93
2.12. Методы контроля качества кисломолочного пробиоти-ка «Лактоацид-Р в соответствии с требованиями к пищевым продуктам 93
2.13. Изучение эффективности применения пробиотика «Лак-
тоацид-Р» на экспериментальных моделях холерной инфекции 93
2.14. Статистическая обработка результатов исследования 94
ГЛАВА 3. Выбор препаратов пробиотиков и выделение чистых культур производственных штаммов пробиотических бактерий 95
3.1. Обоснование выбора препаратов-пробиотиков и выделение чистых культур производственных штаммов пробиотических бактерий 95
3.2. Изучение штамма ацидофильной производственной за кваски на популяционном уровне. Получение авторского штамма Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д и обоснова
ние его использования в работе 98
ГЛАВА 4. Комплексное изучение in vitro штаммов пробиотических микроорганизмов по параметрам биологической активности по отношению к vibrio cholerae 103
4.1. Изучение антагонистической активности пробиотиков по отношению к холерным вибрионам О1, О139 и неО1/неО139 серогрупп in vitro . 103
4.2. Изучение адгезивности пробиотических бактерий 125
4.3. Изучение активности кислотообразования 133
ГЛАВА 5. Разработка критериев отбора штаммов про-биотических бактерий, обладающих активностью по отношению К V.Cholerae 136
5.1. Анализ биологической активности штаммов пробиотиков по сочетанию результатов комплексного изучения in vitro.
Разработка критериев отбора пробиотических бактерий, в том числе на экспериментальных моделях холеры 136
5.2. Способ комплексной оценки активности штаммов пробиотических бактерий по отношению к V.cholerae 146
ГЛАВА 6. Изучение биологических свойств штамма l. acidophilus bkm b-2020 д как основы для разработки нового экспериментального пробиотика 150
6.1. Фенотипическая характеристика штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 151
6.2. Генотипическая характеристика штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 155
6.2.1. Изучение штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д методом ПЦР с набором универсальных праймеров 155
6.2.2. Изучение нуклеотидного состава ДНК штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 156
6.2.3. Гибридизация тотальной ДНК штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 157
6.2.4. Идентификация штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по последовательности гена 16S-рРНК 157
6.2.5. Исследование штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д на наличие плазмид 158
6.3. Антибиотикоустойчивость и чувствительность штамма
L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к антибактериальным препаратам, применяемых для экстренной профилактики и этиотропной терапии холеры 160
6.4. Изучение антагонистической активности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к расширенному диапазону штаммов холерных вибрионов, энтеропатогенных и условно-патогенных бактерий 162
6.4.1. Антагонизм штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к холерным вибрионам, выделенным во время эпидосложне-ний по холере на территории Российской Федерации (1994-2005 гг.) 162
6.4.2. Изучение антагонизма штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к холерным вибрионам О1 серогруп-пы, выделенным при мониторинге объектов окружающей среды 164
6.4.3. Определение антагонистической активности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к холерным вибрионам неО1/неО139 серогрупп, вызвавших диарейные заболевания у людей на территории Ростовской области 166
6.4.4. Изучение антагонизма штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д по отношению к токсигенным штаммам V.cholerae El Tor, завезенным на территорию Российской Федерации (1998-2012 гг.) . 167
6.4.5. Антагонистическая активность штамма L.acidophilus BKM-2020 Д в отношении ЭПМ и УПМ 169
6.5. Определение устойчивости штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д к кислой и щелочной реакции среды, желчи и NaCl 170
6.6. Изучение способности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020
Д к синтезу экзополисахаридов 172
6.7. Система активатор плазминоген/плазмин у штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 174
6.8. Определение вирулентности, токсигенности, токсичности, безвредности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д . 177
6.9. Определение «острой» и «хронической» токсичности штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д . 177
6.10. Экспериментальное изучение биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д 179
6.10.1. Изучение возможности приживления штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д в кишечнике белых мышей на фоне антибиотикотерапии 179
6.10.2. Изучение влияния приобретенной устойчивости к рифампицину на стабильность биологических свойств штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д . 181
ГЛАВА 7. Разработка лабораторных серий нового пробиотика «лактоацид-р» для применения на моделях холерной инфекции 184
7.1. Разработка методики получения лабораторно-экспериментальных серий пробиотика «Лактоацид-Р сухой», контроль качества и характеристика препарата . 184
7.2. Методика изготовления в кисломолочном виде и контроль качества лабораторно-экспериментальных серий «Лактоацид-Р» 190
7.2.1. Разработка модифицированной методики приготов-ления лабораторных серий пробиотиков в кисломолочном виде 191
7.2.2. Характеристика и контроль экспериментального пробиотика «Лактоацид-Р» по требованиям к кисломолочным пищевым продуктам 197
ГЛАВА 8. Оценка активности применения пробиотика «лактоацид-р» при экспериментальной холере 201
8.1. Оценка эффективности применения пробиотика «Лактоацид-Р» при экспериментальной холерной инфекции на модели «опечатанных» взрослых мышей 201
8.2. Оценка эффективности сочетанного использования антибиотиков и лиофилизированного пробиотика при экспериментальной холерной инфекции на модели белых мышей 204
8.3. Модель кроликов-сосунков 207
8.4. Изучение эффективности сочетанного использования пробиотика «Лактоацид-Р» и холерного бактериофага К-1 при лечении экспериментальной холеры 211
8.5. Применение кисломолочного ацидофильного пищевого продукта на основе штамма L.acidophilus ВКМ В-2020 Д для коррекции дисбиотических состояний 216
Заключение 220
Выводы 240
Список использованной литературы
