Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. 2мкм ДНК дрожжей-сахаромицетов ... .....11
2.1.1. Структура и физико-химические свойства дрожжевой плазмиды 11
2.1.2. Внутриклеточная локализация 2мкм ДНК .... 19
2.1.3. Репликация 2мкм ДНК . 22
2.1.4. Функциональное значение 2мкм ДНК ...... 25
2.2. Экстрахромосомная рДНК (Змкм ДНК) дрожжей ... 30
2.3. Матохондриальная ДНК дрожжей-сахаромицетов. . . 32
2.4. Генетическая трансформация дрожжей ...... 39
3. Материалы и методы исследований . ........ . 45
3.1. Микробиологические методы . 45
3.1.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования бактерий 45
3.1.2. Трансформация бактериальных клеток ... 45
3.1.3. Дрожжевые штаммы и условия культивирования дрожжей 46
3.1.4. Трансформация дрожжей 47
3.2. Биохимические методы 49
3.2.1. Выделение тотальной дрожжевой ДНК ... 49
3.2.2. Выделение суперспирализованной дрожжевой
3.2.3. Выделение бактериальной іілазмидной ДНК . 51
3.2.4. Раскапывание градиентов и подготовка к определению радиоактивности исследуемого материала 52
3.2.5. Фракционирование ДНК в градиентах нейтрального хлористого цезия 53
3.2.6. Синтез комплементарной радиоактивной РНК 53
3.2.7. РНК-ДНК гибридизация . 54
3.2.8. Рестрикция ДНК и лигирование рестрик-пионных фрагментов 54
3.2.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле . . 55
3.2.10. Определение концентрации ДНК спектро-флюорометрическим методом 56
3.2.11. Фракционирование РНК электрофорезом
3.2.12. «отографарование флюоресцирующей ДНК в УФ 58
3.2.13. Определение радиоактивности препаратов 58
4, Результаты исследований 60
4.1. Выделение ковалентно-замкнутых ДНК дрожжей, . 60
4.2. Рестрикциоиный анализ 2шш ДНК 67
4.3. Исследование сравнительного содержания 2шш ДНК 73
4.3.1, Очистка ДНКазы от РНКазных примесей. . 76
4.3.2, Получение и очистка транскрипта 2мкм ДНК 79
4.3.3, Определение зависимости уровня гибридизации от количества ДНК на фильтре . 79
4.3.4, Определение влияния избытка гетерологи-чной ДНК на уровень гибридизации зн-кРНК ........ 81
4.3.5, Определение содержания 2мкм ДНК в различных штаммах дрожжей 83
4.4. Определение природы минорной фракции ДНК в препаратах кольцевых ковалентно-замкнутых молекул 87
4.4.1. Очистка и определение плавучей плотности минорной фракции кз ДНК 87
4.4.2. Гибридизация кзДНК с Н-транскриптом мтДНК 88
4.4.3. Электронная микроскопия легкой Фракции кзДНК I . . . 91
4.5. Конструирование двухрешшконной дрожжевой плазмидн 94
4.5.1. Конструирование плазмиды 95
4.5.2. Селекция и идентификация рекомбинантной плазмиды 99
4.5.3. Проверка трансформирующей активности и генетической стабильности плазмиды
в дрожжевых клетках 104
5. Обсуждение результатов НО
Выводы 119
Литература 122
