Введение
ГЛАВА I. Общие сведения о глутамин(аспарагин)азах . . 9
1.1. Методы выделения и очистки глутамин-(аспарагин)
1.2. Влияние физико-химических факторов на активность и стабильность дезамидаз . . 12
ГЛАВА 2. Исследования структуры дезамидаз
2.1. Молекулярная масса и субъединичное строение
2.2. Аминокислотный состав и первичная структура 33
2.3. функциональные группы активного центра
и их модификация 35
ГЛАВА 3. Субстратная специфичность и ингибиторы глутамин(аспарагин)
3.1. Реакции, катализируемые глутамин(ас-парагин)азами
3.2. Константы Михаэлиса 45
3.3. Механизм действия 45
3.4. Аффинные метки 49
3.5. Обратимые ингибиторы 55
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 4. Соединения, использованные в работе
4.1. Реактивы и их очистка 61
4.2. Очистка глутамин(аспарагин)азы 61
а) Источник выделения фермента 62
б) Культивирование микроорганизма ... 63
в) Приготовление ацетонового порошка . . 63
г) Выделение фермента 64
д) Доказательство гомогенности фермента
с помощью диск-электрофореза 67
ГЛАВА 5. Методы определения белка и активности фермента
5.1. Определение белка 70
5.2. Определение активности с помощью реактива Несслера 70
5.3. Определение активности с помощью глутаматдегидрогеназы 72
5.4. Определение активности в реакциях гидролиза и синтеза гидроксаматов дикарбоновых аминокислот 73
ГЛАВА 6. Исследование каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы
6.1. Субстратная специфичность 75
6.2. Влияние концентрации субстратов на скорость реакций гидролиза и гидро-ксиламинолиза 77
6.3. Влияние рН и температуры на активность и стабильность фермента .... 78
6.4. Действие L-глутамата на процесс тепловой инактивации фермента .... 79
6.5. Влияние катионов металлов и метаболитов на ферментативную активность. . . 80
6.6. Ингибирование фермента дикарбоновыми аминокислотами 81
6.7. Кинетика инактивации глутамин(аспара-гин)азы под действием ДОН и азасерина. . 81
6.8. Влияние рН и температуры на инактивацию фермента под действием ДОН 82
6.9. Влияние лигандов на ингибирование фермента ДОН 33
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 7. Исследование оптимальных условий функционирования глутамин(аспарагин)азы
7.1. Влияние рН и температуры на активность
и стабильность глутамин(аспарагин)азы
7.2. Регуляция активности глутамин (аспарагин)азы 9Q
а) Влияние метаболитов на активность фермента
б) Влияние катионов металлов на активность фермента
ГЛАВА 8. Изучение взаимодействия фермента с эффекторами в условиях термоинактивации
8.1. Кинетика инактивации фермента при в присутствии L-глутамата . . 97
8.2. Влияние структуры эффекторов на тепловую стабильность фермента . . . юо
ГЛАВА 9. Субстратная специфичность глутамин(аспарагин) азы
9.1. Реакции гидролиза. Определение для ь -глутамина и L -аспарапша .. Ю5
9.2. Трансферазные реакции 108
9.3. Влияние рН на гидролиз и синтез гидроксамовых кислот 109
9.4. Зависимость скорости трансферазной реакции от концентрации субстратов . . 109
ГЛАВА 10. Исследование каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы методами ингибиторного анализа
10.1. Влияние аналогов субстратов и продуктов на ферментативную активность 114
10.2. Определение кинетики процесса ингибирования фермента ДОН и азасерином 118
10.3. Изучение взаимодействия фермента с іі-аспартатом в условиях инактивации ДОН 123
10.4. Влияние структуры аналогов субстратов на инактивацию фермента
под действием ДОН 126
10.5. Влияние температуры и рН на ингибирование фермента ДОН .... 127
10.6. Влияние органических кислот и их аналогов на взаимодействие фермента с ДОН 130
10.7. Стабилизация фермента от инактивации при низких значениях рН . . . 132
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 134
ВЫВОДЫ 144
ЛИТЕРАТУРА 146
