Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАГОЫ
1.1. Современная классификация протеолитических ферментов. 10
1.2. Области применения протеолитических ферментов микробного происхождения 12
1.3. Методы выделения протеолитических ферментов 15
1.4. Характеристика внеклеточных протеолитических ферментов стрептомщетов на примере протеиназ "проназы" препарата из культуральной жидкости streptomyces griseus к-і ..23
1.4.1. Общая характеристика "проназы"... 23
1.4.2. Трипсиноподобный фермент "проназы" 26
1.4.3. Хиштрипсиюподобные ферменты "проназы" 29
1.4.4. Субтилизиноподобные ферменты "проназы" 38
1.4.5. Аминопептидазы "проназы" ...43
1.4.6. Карбоксипептидаза "проназы" ...48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ I. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Список сокращении, использованных в работе 59
2.2. Выращивание продуцента 60
2.3. Сорбенты, использованные для выделения и очистки протеолитических ферментов 61
2.3.1. Ионообменные материалы 61
2.3.2. Аффинные сорбенты 62
2.3.3. Сорбенты для гельхроматографии 63
2.4. Субстраты для оцределения цротеолитической активности 63
2.5. Ингибиторы протеиназ 63
2.6. Методы определения концентрации белка 64
2.7. Методы определения протеолитической активности 64
2.7.1. Определение неспецифической протеолитической активности по денатурированным растворимым белкам 64
2.7.2. Определение активности по нерастворимым белковым субстратам .64
2.7.3. Метод оцределения фибринолоззической активности в тонком слое 65
2.7.4. Метод определения тромболитической активности 66
2.7.5. Определение литической активности 66
2.7.6. Определение эстеразной активности протеиназ .66
2.7.7. Определение амидазной активности 67
2.7.8. Определение карбоксипептидазной активности .6S
2.7.9. Изучение субстратной специфичности карбокси-пептидазы .69
2.8. Методы выделения комплексного препарата протеолитических ферментов Str.spheroid.es шт.35 и отдельных его компонентов 70
2.8.1. Выделение комплексного препарата из культуральной жидкости Str.spheroid.es шт.35 .
осаждением сульфатом аммония, ионообменной хроматографией на ДЕ№-целлюлозе, гельхрома-тографией на сефадексе G -75 70
2.8.2. Получение комплексного препарата протеиназ методом аффинной хроматографии 71
2.8.3. Выделение субтилизиноподобной протеиназы SSPB Str.spheroides шт.35 ,71
2.8.4. Выделение химотрипсиноподобной протеиназы
72
SSPG Str.spheroides ШТ.35 .
2.8.5. Выделение лейцинаминопептидазы и второго химотрипсиноподобного фермента SSPI str. spheroides шт.35 73
2.8.6. Выделение карбоксипептидазы str.spheroides шт.35 73
2.9. Методы биохимического и физико-химического
исследования гомогенных ферментов 74
2.9.1. Определение рН-оптимума активности .- 74
2.9.2. Определение температурного оптимума активности,.74
2.9.3. Изучение рН-устойчивости ферментов ...75
2.9.4. Изучение термостабильности ферментов , 75
2.9.5. Диск-электрофорез белков в полиакриламидномгеле 75
2.9.6. Изоэлектрофокусирование .76
2.9.7. Определение молекулярной массы ферментов .77
2.9.8. Определение аминокислотного состава ...77
2.9.9. Определение її-концевой аминокислотной 78 последовательности
2.10. Метод изучения тромболитической активности препарата протеиназ Str.spheroides шт.35 in vivo 78
2.11. Исследование фибринолитической системы крови при внутривенном введении препарата протеиназ str. spheroides шт.35 .79
ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Str.spheroides ШТ.35
3.1. Изучение динамики накопления протеиназ- в процессе роста культуры .80
3.2. Выделение и некоторые свойства комплекса протеиназ str.spheroides шт.35, полученного методом осаждения сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, гельхроматографии на сефадексе G-75..J 84
3.3. Изучение биологической активности препарата протеиназ Str.spheroides шт.35 ..90
3.3.1. Изучение тромболизиса у крыс при внутривенном введении препарата , .90
3.3.2. Изучение биохимических показателей крови крыс при внутривенном введении препарата протеиназ Str.spheroides шт.35 91
3.3.3. Исследование токсичности ферментного препарата протеиназ str.spheroides шт.35 .94
3.4. Выделение комплексного препарата протеолитических ферментов методом аффинной хроматографии и исследование его некоторых свойств ..95
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СУБТИЛИЗИНО-П0Д0БН0Й ПЮТЕИНАЗЫ SSPG Str.spheroides шт.35
4.1. Выделение и очистка SSPB .102
4.2. Изучение физико-химических свойств SSPB 113
4.3. Влияние ингибиторов на активность SSPB , 116
4.4. Поведение SSPB в 6М гуанидингидрохлориде 117
4.5. Субстратная специфичность SSPB JI8
4.6. Аминокислотный состав SSPB J24
ГЛАВА 5. ВЫДЕЯЕШЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ХШОТРИПСИНОПОДОБШХ ПРОТЕИНАЗ SSPG и SSPI.
5.1. Выделение и очистка SSPG И SSPI . 127
5.2. Изучение физико-химических СВОЙСТВ SSPG 135
5.3. Влияние ингибиторов на активность SSPG J35
5.4. Поведение SSPG в 6М гуанидингидрохлориде 138
5.5. Субстратная специфичность SSPG 140
5.6. Аминокислотный состав SSPG 142
ГЛАВА 6. ВЫДЕЯЕНИЕ, ОЧИСТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ
СВОЙСТВ ЛЕШНАМИНОПЕШИДАЗЫ Str.spheroides шт.35
6.1. Выделение и очистка лейцинаминопептидазы 145
6.2. Исследование некоторых энзиматических и физико-химических свойств лейцинаминопептидазн 148
ГЛАВА 7. ВЫДЕЯЕНИЕ И ХАРАКТЕШСТИКА КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Str.spheroides шт.35
7.1. Выделение и очистка карбоксипептидазы 152
7.2. Изучение некоторых физико-химических свойств карбоксипептидазы 152
7.3. Влияние ингибиторов на активность карбоксипептидазы..158
7.4. Субстратная специфичность карбоксипептидазы .160
7.5. Аминокислотный состав карбоксипептидазы 163
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 165
ВЫВОДЫ 171
ЛИТЕРАТУРА Ї73
