Введение
ГЛАВА 1. Рибосомные белки эукариот: регуляция экспрессии их генов и внерибосомные функции (Обзор литературы) 9
1.1. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков 10
1.1.1. Регуляция на уровне транскрипции 10
1.1.2. Регуляция на стадии сплайсинга 15
1.1.2.1. Традиционный сплайсинг 16
1.1.2.2. Альтернативный сплайсинг 19
1.1.3. Регуляция на стадии трансляции 25
1.1.3.1. Особенности регуляции трансляции мРНК рибосомных белков 25
1.1.3.2. Структурные элементы мРНК рибосомных белков, участвующие в регуляции трансляции 26
1.1.3.3. Белковые факторы, связывающиеся с 5-UTR мРНК рибосомных белков 29
1.1.3.4. Роль компонентов аппарата трансляции в регуляции трансляции мРНК рибосомных белков 31
1.2. Внерибосомные функции рибосомных белков 34
1.2.1. Ферментативная активность рибосомных белков 35
1.2.2. Связь между рибосомпьши белками и апоптозом 35
1.2.3. Роль рибосомных белков при злокачественной трансформации клеток 39
1.2.3.1. Экспрессия генов рибосомных белков в опухолевых клетках 39
1.2.3.2. Функции рибосомных белков при злокачественной трансформации 41
1.2.4. Рибосомные белки как антигены при аутоиммунных заболеваниях 44
1.2.5. Участие рибосомных белков в клеточном ответе на вирусную инфекцию 45
1.2.6. Влияние рибосомных белков на эмбриональное развитие 47
1.2.7. Несистематизированные внерибосомные функции 48
1.3. Заключение 52
ГЛАВА 2. Рибосомный белок S26 человека: взаимодействие с собственной пре-мРНК и участие в регуляции ее сплайсинга 54
2.1. Результаты 54
2.1.1. ДНК-матрицы для синтеза РНК-транскриптов, соответствующих различным фрагментам мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26 54
2.1.2. Связывание суммарного 40S рибосомного белка с фрагментами мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26 55
2.1.3. Влияние рибосомных белков на взаимодействие белков ядерного экстракта с первым интроном пре-мРНК рибосомного белка S26 59
2.1.4. Получение специфической антисыворотки против rpS26 и рекомбипантного рибосомного белка S26 человека 61
2.1.4.1. Выделение индивидуального rpS26 человека и получение специфичной антисыворотки против него 61
2.1.4.2. Получение рекомбипантного rpS26 человека 62
2.1.5. Связывание рекомбипантного рибосомного белка S26 с фрагментами собственных мРНК и пре-мРНК 64
2.1.6. Связывание эндогенного rpS26 ядерного экстракте клеток HeLa с фрагментами собственных мРНК и пре-мРНК 65
2.1.6.1. Выделение специфичных антител против rpS26 из антисыворотки, полученной против rpS26 65
2.1.6.2. Связывание rpS26 в составе ядерного экстракта клеток HeLa с фрагментами собственных мРНК и пре-мРНК 66
2.1.7. Влияние rpS26 на сплайсинг собственной пре-мРНК 68
2.1.8. Определение участков мРНК и пре-мРНК, вовлеченных во взаимодействие с рибосомным белком S26 69
2.2. Обсуждение результатов 74
2.2.1. Связывание рибосомных белков 40S субчастиц рибосом человека с мРНК и пре-мРНК rpS26 74
2.2.2. Участки связывания рибосомпого белка S26 на пре-мРНК и мРНК 77
2.2.3. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК рибосомного белка S26 78
2.2.4. Роль рибосомного белка S26 человека в регуляции сплайсинга собственной пре-мРНК 79
2.2.5. Предлагаемые механизмы, по которым происходит регуляция сплайсинга пре-мРНК рибосомного белка S26 80
2.3. Заключение S1
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 82
3.1. Материалы 82
3.2. Выделение 40S субчастиц рибосом человека 83
3.3. Выделение суммарного 40S рибосомного белка 84
3.4. Анализ рибосомных белков одномерным и двумерным гель-электрофорезом 85
3.5. Получение кДНК для синтеза фрагментов мРНК и пре-мРНК рибосомного белка S26 человека 86
3.6. Получение меченых и немеченых РНК-транскриптов 87
3.7. Получение рекомбинантного рибосомного белка S26 человека 87
3.8. Получение специфичной антисыворотки против рибосомного белка S26 89
3.9. Выделение антител против рибосомного белка S26 89
3.10. Получение ядерного экстракта клеток HeLa 90
3.11. Связывание рибосомных белков с РНК-транскриптами 91
3.11.1. Связывание на нитроцеллюлозных фильтрах 91
3.11.2. РНК-белковый блотинг 91
3.11.3. Связывание в составе ядерного экстракта клеток HeLa 92
3.12. Прямые УФ-индуцируемые сшивки белков ядерного экстракта с РНК-транскриптами 92
3.13. Сплайсинг фрагмента пре-мРНК in vitro и анализ продуктов сплайсинга 93
3.14. Тоу-принтинг комплексов рибосомного белка S26 с
фрагментами своих мРНК и пре-мРНК 94
Выводы 95
Список литературы 96
