Введение
Глава 1. Структура боковых петель РНК и их чувствительность к расщеплению (Обзор литературы) 9
1.1. Основные элементы вторичной структуры РНК 9
1.2. Методы исследования структуры баковых петель в ДНК- и РНК-дуплексах 12
1.3. Структура боковых петель в составе РНК 12
1.3.1. Боковая петля, состоящая из одного основания 12
1.3.1.1 Структура однозвенных А петель, полученная с помощью ЯМР и РСА 13
1.3.1.2. Структура однозвенной А петли в составе ДНК:РНК дуплекса 14
1.3.1.3. Расчетная конформация однозвенной А петли в составе дуплекса 15
1.3.2. Однозвенные G-содержащие петли 16
1.3.3. Однозвенные U-содержащие петли 17
1.3.4. Однозвенные С-содержащие петли 20
1.3.5. Структура петель, содержащих более одного нуклеотида 20
1.3.6. Влияние ионов Мд2+ на структуру боковой петли 22
1.4. Изучение структуры РНК, содержащих петли, с помощью электрофореза в нативных условиях и метода индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления (transient electric birefringence) 24
1.5. Термодинамические характеристики дуплексов, содержащих боковые петли 25
1.6. Чувствительность фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК к расщеплению 27
1.6.1. Зависимость стабильности РНК от геометрических параметров межнулеотидной связи 27
1.6.2. Расщепление РНК в боковых петлях 30
1.6.2.1. Расщепление боковых петель РНК ионами металлов 30
1.6.2.2. Расщепление искусственных боковых петель РНК конъюгатами олигонуклеотидое и комплексов металлов 34
Заключение 39
Глава 2. Экспериментальная часть 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Реактивы и препараты 41
2.1.2. Плазмиды 42
2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК 42
2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды 42
2.1.5. Буферные растворы, использованные в работе 43
2.2. Методы 45
2.2.1. Гель-электофореэ 45
2.2.1.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 45
2.2.1.2. Электрофорез в агарозном геле 45
2.2.2. Приготовление компетентных клеток 46
2.2.3. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК pSVK3M2 46
2.2.4. Выделение плазмидной ДНК (аналитический вариант) 46
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК (препаративный вариант) 47
2.2.6. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro 48
2.2.6.1. Получение линейной формы плазмиды 48
2.2.6.2. Амплификация фрагмента М2 РНК вируса гриппа 49
2.2.6.3. Очистка ПЦР-продукта 49
2.2.6.4. Транскрипция in vitro 49
2.2.6.5. Очистка РНК-транскриптов 50
2.2.7. Получение радиоактивно меченых препаратов РНК и олигонуклеотвдов 50
2.2.7.1. Введение [33Р]-метки по З-ОН группе TPHKptie 50
2.2.7.2. Введение [згР]-метки по 5-концу РНК 50
2.2.8. Пробинг вторичной структуры РНК в растворе 50
2.2.8.1. Пробинг вторичной структуры фрагмента М2 РНК вируса гриппа 51
2.2.8.2. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях 51
2.2.8.3. Пробинг вторичной структуры мини-тРНК и комплексов М2-96 РНК: олигонуклеотид в имидазольном и метилимидазольном буферах 52
2.2.9. Пробинг дуплексов РНК:олигонуклеотид РНКазой Н 52
2.2.10. Пробинг дуплексов РНК:олигонуклеотид РНКазой А 52
2.2.11. Компьютерное моделирование вторичной структуры М2-96 РНК 53
2.2.12. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с М2-96 РНК методом задержки в геле 53
2.2.13. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами 53
2.2.14. Расщепление М2-96 РНК в комплексе с олигодезоксирибонуклеотидами с помощью химических рибонуклеаз 54
Глава 3. Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз (Результаты и обсуждение) 55
3.1. Рибонуклеазная активность коротких синтетических пептидов, состоящих из остатков лизина и гистамина 55
3.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз серии nLm 55
3.1.2. РНК-мишени 58
3.1.3. Зависимость эффективности расщепления РНК под действием соединенийп[ т от длины и вторичной структуры субстрата 61
3.1.4. Специфичность расщепления РНК соединениями nLm 64
3.1.5. Влияние концентрации соединений nLm на их рибонуклеазную активность 68
3.1.6. Влияние природы буфера на расщепление РНК соединениями nLm 70
3.1.7. Механизм расщепления РНК соединениями nLm 72
3.1.8. Сравнение рибонуклеазной активности соединений nLm и ABLkCm 72
3.2. Рибонуклеазная активность трипептидов, состоящих из аминокислот, входящих в состав активных центров природных рибонуклеаз А и Т1 75
3.2.1. Дизайн трипептидов 75
3.2.2. РНК-мишени 75
3.2.3. Изучение РНК-расщелляющей активности трипептидов 77
3.2.4. Специфичность расщепления РНК трипептидами 79
3.2.5. Влияние концентрации трипептидов на их рибонуклеазную активность 80
3.3. Рибонуклеазные свойства соединений на основе соединенных жестким линкером двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]сктана, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота 82
3.3.1. Дизайн соединений Dxn 82
3.3.2. РНК-мишени 82
3.3.3. Расщепление ON21 соединениями серии Dxn 83
3.3.4. Концентрационные зависимости расщепления РНК соединениями Dxn 86
3.3.5. Кинетика расщепления РНК под действием соединений Dxn 90
3.3.6. Специфичность расщепления РНК под действием соединений Dxn 94
3.3.7. Влияние имидазола на РНК-расщепляющую активность соединения Dpi 2 96
3.3.8. Сравнение PHK-расщєпляющей активности соединений серии Dxn с соединением ABL4C3 97
3.4. Направленное расщеппение РНК химическими рибонуклеазами по фосфодиэфирным связям в боковых петлях 99
3.4.1. РНК-мишень 99
3.4.1.1. Изучение вторичной структуры М2-96 РНК 99
3.4.2. Олигонукпеотиды и РНК-расщепляющие конструкции 103
3.4.3. Образование искусственных петель 106
3.4.3.1. Закономерности образования комплексов М2-96 РНКюлигонуклеотид 106
3.4.3.2. Пробинг комплексов М2-96 РНК;олигонуклеотид с помощью РНКазы Н 108
3.4.3.3. Пробинг комплексов М2-96 РНКюлигонуклеотид РНКазой А 109
3.4.3.4. Расщепление комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид в 2 М имидазольном буфере 111
3.4.4. Расщепление фосфодиэфирных связей в искусственных петлях соединениями KHR, 2L2, Dpi 2 и ABL4C3 112
3.4.5. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид соединением KHR 115
3.4.6. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид соединением Dp 12 118
3.4.7. Эффективность и селективность расщепления комплексов М2-96 РНКюлигонукпеотид соединением ABL4C3 119
3.4.8. Расщепление комплексов М2-96 РНКюлигонукпеотид соединениями ABL4C3, Dp12 и KHR в присутствии 10 мМ MgCI2 120
Выводы 128
Список литературы 130
