Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1 Боковой амиотрофический склероз (БАС)
1.1.1Клеточная терапия бокового амиотрофического склероза
1.1.2 Генная терапия бокового амиотрофического склероза 24
1.2 Вирусные векторы для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот 32
1.2.1 Аденовирусы 33
1.2.2. Адено-ассоциированные вирусы 37
1.2.3. Векторы на основе вируса простого герпеса (Herpes Simplex) 39
1.2.4 Лентивирусы 40
1.3Плазмидные векторы для переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот
1.4 Стратегии ко-экспрессии генов 44
1.4.1. Сайты внутреннего встраивания в рибосому (IRES) 45
1.4.2. Двунаправленные промоторы 48
1.4.3. 2А-пептидные последовательности пикорновирусов 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1 Получение рекомбинантного аденовируса с использованием технологии клонирования Gateway 59
2.1.1. ПЦР-амплификация 59
2.1.2 Клонирование продукта амплификации VEGF-FuP2A-FGF2 в плазмидный вектор pDONR221 (Invitrogen) 59
2.1.3. Получение экспрессионной конструкции pAd/CMV/V5-Dest 64
2.1.4 Получение рекомбинантного аденовируса ко-экспрессирующего гены vegf165 и fgf2 65
2.2 Получение мультицистронной конструкции на основе плазмиды pEGFP N2, ко-экспрессирующей гены vegf165 и fgf2 69
2.2.1 Клонирование ПЦР-продуктов в плазмидные векторы pJET1.2/blunt и pEGFP-N2 70
2.3 Исследование ко-экспрессии генов vegf, fgf2 в составе экспрессионных плазмидных конструкций in vitro 73
2.3.1 Генетическая модификация культуры клеток HEK293T рекомбинантной плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 и pVEGF165-FuP2A-FGF2 P2A-EGFP 74
2.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ генетически модифицированных клеток 74
2.3.3. Оценка биосинтеза белка in vitro методом иммуноблоттинга 75
2.4 Исследование иммуногенности 2А-пептидных препаратов 77
2.4.1.Получение антител к 2А-пептиду 78
2.4.2 Иммуноферментный анализ 79
2.5 Исследование ко-экспрессии генов vegf165 и fgf2 на экспериментальной модели животных, моделирующих фенотип бокового амиотрофического склероза 80
2.5.1 Выделение и генетическая модификация мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека 81
2.5.2 82 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток трансгенным мышам, модулирующих фенотип бокового амиотрофического склероза 82
2.5.3 Иммуногистохимический анализ экспрессии белков VEGF и FGF2 in vivo 83
ГЛАВА 3. Результаты исследований 85
3.1 Создание мультицистронной аденовирусной конструкции, содержащей кДНК генов vegf165 и fgf2 85
3.1.2. Получение рекомбинантного аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2
3.1.3 Создание мультицистронной плазмидной конструкции, содержащей кДНК генов vegf165 и fgf2 92
3.2 Исследование ко-экспрессии, биосинтеза и ко-трансляционного расщепление рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в первичных и иммортализованных культурах клеток человека 94
3.2.1 Исследование ко-экспрессии генов VEGF165 и FGF2 в генетически модифицированных первичных и перевиваемых клеточных культурах 94
3.2.2 Количественный анализ уровня экспрессии мРНК генов vegf165 и fgf2 101
3.3.1 Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков в составе мультицистронной аденовирусной конструкции 104
3.3.2 Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в составе плазмидной конструкции in vivo 106
3.4 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза 108
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 112
Заключение 124
Выводы 126
Список литературы 127
