Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Немелкоклеточный рак легкого. Разнообразие форм данного вида опухолей 12
1.2 Генетические мутации как наиболее частые причины развития легочной аденокарциномы 13
1.3 Трансгенные мыши как модель исследования опухолей легкого 15
1.4 Роль стволовых клеток в развитии рака легкого 17
1.5 Эпителиально-мезенхимальный переход и его роль в метастазировании опухолей 17
1.6 TGF-/SMAD – один из основных сигнальных путей, активирующих процесс эпителиально-мезенхимального перехода 19
1.7 Плотные межклеточные контакты, их строение и роль 21
в эпителиально-мезенхимальном переходе 21
1.8 Эволюционно консервативные белки Мусаши – потенциальные регуляторы эпителиально-мезенхимального перехода 23
1.9 Основные мишени белков Мусаши, регулирующие рост и метастазировании опухолей 26
1.10 Заключение 28
Экспериментальная часть 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1 Реактивы и оборудование 30
2.2 Объекты исследования
2.2.1 Объекты исследования in vitro 34
2.2.2 Объекты исследования in vivo 36
2.3 Анализ экспрессии Msi2 в образцах ткани легкого с помощью метода тканевых матриц 37
2.4 Подготовка и иммуногистохимическое окрашивание образцов опухолей и метастазов мышей
2.5 Количественный анализ препаратов, полученных in vivo 39
2.6 Анализ уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 40
2.7 Количественный анализ уровней белков с помощью метода протеиновых тест-систем обратной фазы (RPPA) 40
2.8 Трансфекция клеток малой интерферирующей РНК 41
2.9 Получение клонов нокдаунов Msi2 с помощью коротких шпилечных РНК и лентивирусов 41
2.10 Анализ жизнеспособности клеток in vitro 42
2.11 Анализ инвазивной способности клеток in vitro 43
2.12 Оценка роста клеток с помощью 43
метода выращивания трехмерных клеточных сфер 43
2.13 Анализ уровня экспрессии белков методом Вестерн блоттинга 44
2.14 Исследование клеток с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии 45
2.15 Эксперименты со сверхэкспрессией генов 46
2.16 Исследование клеточного цикла с помощью проточной цитометрии 47
2.17 Статистическая обработка данных 48
ГЛАВА 3. Результаты исследования 49
3.1 Исследование экспрессии гена Msi2 в легочной аденокарциноме с высокой метастатической способностью 49
3.2 Исследование влияния экспрессии Msi2 на инвазивную способность клеток легочной аденокарциномы с высоким метастатическим потенциалом in vitro 52
3.3 Опухоли с пониженной экспрессией Msi2 демонстрируют меньшую метастатическую активность in vivo 55
3.4 Определение основных белков-мишеней Msi2 в опухолях легкого 57
3.5 Исследование влияния Msi2 на трансляцию белков-мишеней, регулирующих инвазию 61
3.6 Влияние уровня Msi2 на изменение межклеточных контактов и фенотип смешанного эпителиально-мезенхимального перехода 63
3.7 Msi2 регулирует инвазию, влияя на сигнальный путь TGF- и экспрессию клаудинов 67
3.8 Msi2 оказывает влияние на механизмы репарации ДНК и является потенциальным маркером эффективности химиотерапии рака легкого 71
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 75
Выводы 80
Список литературы
