Оглавление
Введение ................................................................................................................. 8
Актуальность исследования ............................................................................. 8
Степень разработанности темы исследования ............................................... 8
Цель и задачи ................................................................................................... 10
Новизна, практическая и научная значимость результатов проведенных
исследований .............................................................................................................. 10
Методология и методы исследования ........................................................... 12
Положения, выносимые на защиту ................................................................ 12
Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в
диссертации ................................................................................................................ 13
Степень достоверности и апробация работы ................................................ 14
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 16
1.1. Наночастицы для терапии и визуализации опухолей ........................... 16
1.1.1. Магнитные наночастицы ...................................................................... 16
1.1.2. Плазмонные наночастицы .................................................................... 19
1.1.3. Полимерные наночастицы ................................................................... 22
1.2. Транспорт наночастиц к раковым клеткам ............................................ 24
1.2.1. Повышенная проницаемость солидных опухолей ............................ 24
1.3. Активная доставка лекарств .................................................................... 27
1.3.1. HER2 рецептор ...................................................................................... 30
1.4. Альтернативные аффинные каркасные белки ....................................... 33
1.4.1. Дарпины ................................................................................................. 36
1.4.2. Аффибоди .............................................................................................. 38
3
Аффибоди для визуализации ......................................................................... 41
Аффибоди для терапии ................................................................................... 42
1.5. Белковая пара барназа-барстар для создания самособирающихся
многофункциональных наноконструкций .............................................................. 45
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ........................................................................... 53
2.1. Материалы ................................................................................................. 53
2.2. Буферные растворы .................................................................................. 54
2.3. Эукариотические клеточные линии ........................................................ 57
2.3.1. Линии эукариотических клеток ........................................................... 57
2.3.2. Анализ жизнеспособности клеток ....................................................... 58
2.3.3. Измерение уровня активных форм кислорода ................................... 60
2.3.4. Проточная цитометрия ......................................................................... 61
2.4. Прокариотические клетки ........................................................................ 61
2.4.1. Бактериальные штаммы ....................................................................... 61
2.4.2. Получение компетентных клеток ........................................................ 62
2.4.3. Трансформация методом теплового шока .......................................... 62
2.4.4. Наработка и выделение плазмидной ДНК ......................................... 63
2.5. Выделение и очистка белков ................................................................... 63
2.5.1. Экспрессия белков в бактериальной системе. Хроматографическая
очистка белков ........................................................................................................ 63
2.5.2. Электрофорез в ПААГ .......................................................................... 66
2.5.3. Определение концентраций белков .................................................... 66
2.5.4. Определение ферментативной активности белков............................ 67
2.5.5. Модификации и мечение белков ......................................................... 68
4
2.6. Синтез, характеризация и модификация наночастиц ........................... 69
2.6.1. Сканирующая электронная микроскопия........................................... 69
2.6.2. Гидродинамическое рассеяние света .................................................. 69
2.6.3. Количественный анализ связывания магнитных частиц с клетками
.................................................................................................................................. 70
2.7. Синтез наночастиц PLGA, загруженных флуоресцентными
красителями ................................................................................................................ 71
2.7.1. Синтез наночастиц PLGA .................................................................... 71
2.7.2. Характеризация НЧ PLGA ................................................................... 72
2.7.3. Анализ специфичности связывания методом проточной цитометрии
.................................................................................................................................. 73
2.7.4. Исследование фототермических свойств ........................................... 74
2.7.5. Фототерапия in vitro .............................................................................. 74
2.7.6. Конфокальная микроскопия ................................................................ 75
2.7.7. Мышиная модель HER2-положительной опухоли ............................ 75
2.7.8. Визуализация опухолей in vivo ............................................................ 76
2.8. Наночастицы магнетита ........................................................................... 77
2.8.1. Флуоресцентная спектроскопия .......................................................... 77
2.8.2. Мечение клеток структурами DARPin9.29-Bn * Bs-C-Mms6-ФИТЦ
.................................................................................................................................. 77
2.8.3. Мечение клеток DARPin9.29-Bn* ФИТЦ ........................................... 77
2.8.4. Мечение клеток структурами DARPin9.29-Bn* Bs-c-Mms6-ФИТЦ 78
3. РЕЗУЛЬТАТЫ .............................................................................................. 79
3.1. Наночастицы PLGA, загруженные двумя БИК красителями, для
визуализации и фототерапии HER2-положительных раковых клеток ................ 79
5
3.1.1. Синтез и характеристика наночастиц PLGA ...................................... 79
3.1.2. Исследование фототермических свойств наночастиц PLGA,
загруженных БИК красителями ............................................................................ 81
3.1.3. Исследование фотосенсибилизирующих свойств наночастиц PLGA,
загруженных БИК красителями ............................................................................ 82
3.1.4. Направленная доставка наночастиц PLGA, нагруженных красителем,
к HER2-положительным клеткам: оценка специфичности и цитотоксичности
.................................................................................................................................. 83
3.1.5. Фототерапия in vitro с использованием НЧ PLGA, нагруженных БИК
красителем ............................................................................................................... 84
3.1.6. Визуализация опухолей EMT6/p-HER2 in vivo при помощи НЧ
PLGA+IR-780+NB .................................................................................................. 86
3.1.7. Обсуждение ........................................................................................... 87
3.2. Сравнение белков, распознающих рецептор HER2, для модификации
магнитных наночастиц для специфичного мечения HER2-положительных клеток
...................................................................................................................................... 90
3.2.1. Выделение и очистка белков, распознающих рецептор HER2.
Модификация магнитных наночастиц распознающими белками ..................... 90
3.2.2. Специфичность связывания конъюгатов магнитных наночастиц с
HER2 положительными раковыми клетками ...................................................... 92
3.2.4. Обсуждение .......................................................................................... 93
3.3. Плазмонные наночастицы серебра, модифицированные аффибоди Z342,
для фототермической терапии HER2-положительных опухолей ......................... 96
3.3.1. Характеризация плазмонных наночастиц серебра ............................ 96
3.3.2. Модификация поверхности наночастиц серебра ............................... 97
6
3.3.3. Мечение HER2-положительных раковых клеток при помощи
наночастиц Ag-PEG-HER2 .................................................................................... 98
3.3.4. Исследование фотосенсибилизирующих свойств наночастиц Ag
PEG-HER2 ............................................................................................................. 100
3.4. Сочетанная терапия адресного иммунотоксина DARP-LoPE и
наночастиц PLGA-аффибоди, нагруженных доксорубицином, нацеленных на
разные участки рецептора HER2 ............................................................................ 102
3.4.1. Выделение рекомбинантных белков иммунотоксина DARP-LoPE и
аффибоди ZHER2:342 ................................................................................................ 102
3.4.2. Наночастицы PLGA-аффибоди для направленного воздействия на
HER2-положительные клетки ............................................................................. 103
3.4.5. Комбинированное воздействие наночастиц PLGA*DOX*аффибоди и
иммунотоксина in vitro. ....................................................................................... 104
3.5. Метод модификации наночастиц магнетита с использованием
магнетит-связывающего белка и белковой пары барназа-барстар для
специфичного воздействия на HER2-положительные клетки ............................ 106
3.5.1 Выделение и очистка белка Bs-С-Mms6 ............................................ 106
3.5.2. Проверка активности белка Bs-С-Mms6 ........................................... 106
3.5.3 Специфичная сборка белкового модуля барназа-барстар на
поверхности клеток .............................................................................................. 108
3.5.4. Получение стабильных наночастиц МЧ*Bs–C–Mms6.................... 109
3.5.5. Специфичная сборка белкового модуля барназа-барстар на
поверхности наночастиц ...................................................................................... 110
3.5.6. Оценка биосовместимости белка Bs-C-Mms6 и модифицированных
им наночастиц магнетита .................................................................................... 110
7
3.5.7. Связывание МЧ*Bs-C-Mms6*DARPin9.29-Bn с клетками со
сверхэкспрессией рецептора HER2 .................................................................... 111
Выводы ............................................................................................................... 113
Список использованных сокращений ............................................................. 115
Список литературы ........................................................................................... 118
