ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 18
1.1. Характеристика тритикале 18
1.1.1. Происхождение и биологические особенности тритикале 18
1.1.2. Селекционно-генетические аспекты качества зерна тритикале 21
1.2. Транскриптомные особенности развитие зерновки 22
1.2.1 Динамика транскриптома в процессе развития зерновки 25
1.3. Геномные особенности зерновых культур 28
1.4. Запасные белки зерновки пшеницы и тритикале 29
1.4.1. Характеристика глютенинов 29
1.4.2. Низкомолекулярные глютенины (LMW-GS) 31
1.4.3. Высокомолекулярные глютенины (HMW-GS) 32
1.4.4. Полиморфизм генов высокомолекулярных глютенинов 33
1.4.5. Регуляция экспрессии генов глютенинов 36
1.5. Классификация и функции длинных некодирующих РНК 40
1.5.1. Классификация некодирующих РНК 40
1.5.2. Значение днРНК в индивидуальном развитии растений 41
1.6. Секвенирование и аннотация геномов пшеницы, ржи и тритикале 43
1.7. Секвенирование целевых последовательностей 46
РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
2.1. Материалы для исследования 53
2.2. Методы исследования 53
2.2.1. Выделение ДНК 53
2.2.2. Обогащение геномной ДНК высокомолекулярными фрагментами 55
2.2.3. Дизайн гидовой РНК 55
2.2.4. Синтез и очистка гРНК 56
2.2.5. Подготовка библиотеки nCATS 57
2.2.6. Нанопоровое секвенирование 60
2.2.7. Анализ данных, полученных с помощью секвенирования 60
2.2.8. ПЦР-подтверждение вставки в ген Glu-1Bx 60
2.2.9. ПЦР-амплификация последовательностей генов высокомолекулярных
субъединиц глютенинов 60
2.2.10. Валидация делеции в гене Glu-1Bx7 62
2.2.11. Нанопоровое секвенирование ампликонов и анализ полученных
данных 62
2.2.12. Выделение тотальной РНК 63
2.2.13. Выделение поли(A)-РНК 63
2.2.14. Подготовка библиотеки для Direct RNA-Seq Nanopore 63
2.2.15. Проведение ПЦР и электрофореза 64
2.2.16. Синтез дц-кДНК 64
2.2.17. Биоинформатический анализ данных секвенирования дц-кДНК 65
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 67
3.1. Cas9-опосредованное нанопоровое секвенирование (nCATS) генов
высокомолекулярных глютенинов
67
3.1.1. Подготовка ДНК библиотеки и секвенирование nCATS
3.1.2. Идентификация структурных вариаций гена Glu-1By
3.1.3. Детекция метилирования
70
72
74
3.2. Секвенирование и анализ вариабельности генов высокомолекулярных
глютенинов методом Nanopore Amplicon-seq
76
3.2.1. Амплификация полноразмерных генов глютенина
77
3.2.2. Анализ последовательностей аллелей HMW-GS, полученных с
помощью ONT Amplicon-Seq
84
3.2.3. Филогенетический анализ аллелей генов глютенинов
3.2.4. Преимущества Nanopore Amplicon-Seq для анализа HMW-GS
88
91
3.3. Анализ транскриптома зерновок тритикале с помощью Нанопорового
секвенирования
93
3.3.1.
Анализ транскриптов, полученных с помощью Нанопорового
секвенирования, по белок-кодирующему потенциалу
94
3.3.2. Характеристика генов, экспрессирующихся на разных стадиях развития
зерновки
99
3.3.3. Особенности транскриптома зародыша и эндосперма развивающихся
зерновок
104
3.3.4. Полиморфизм генов днРНК в коллекции тритикале
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
109
113
114
115
