ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................... 4
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................ 9
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................... 9
1.1 Проблема устойчивости бактерий к антибиотикам ....................................................... 9
1.1.1 Резистентность к антибиотикам.................................................................................... 10
1.1.2 Персистенция бактерий ...................................................................................................11
1.2 Факторы образования персистеров ................................................................................. 15
1.2.1 Дормантность бактерий................................................................................................. 16
1.2.2 Токсин-антитоксиновые модули ................................................................................... 17
1.2.3 Системы синтеза алармонов у бактерий ...................................................................... 19
1.3 Суперсемейство белков RSH.............................................................................................. 23
1.3.1 Длинные гомологи RelA/SpoT....................................................................................... 24
1.3.2 Малые алармонсинтетазы ............................................................................................. 29
1.4 Ингибиторы алармонсинтетаз бактерий ........................................................................ 33
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ........................................................................................................ 38
2.1 Микробиологические методы............................................................................................ 38
2.1.1 Объекты исследования .................................................................................................. 38
2.1.2 Культивирование микроорганизмов ............................................................................. 38
2.1.3 Определение минимальной подавляющей и минимальной бактерицидной
концентрации антибиотика ....................................................................................................... 40
2.1.4 Кривые отмирания......................................................................................................... 40
2.1.4 Определение уровня выживаемости и частоты образования персистеров............... 41
2.1.6 Исследование комбинированного воздействия антибиотиков .................................. 42
2.2 Молекулярно-биологические методы.............................................................................. 42
2.2.1 Подбор праймеров ......................................................................................................... 42
2.2.2 Полимеразная цепная реакция ..................................................................................... 43
2.2.3 Электрофорез в агарозном геле .................................................................................... 45
2.2.4 Электропорация ............................................................................................................. 46
2.2.5 Осаждение этанолом...................................................................................................... 46
2.2.6 Выделение плазмидной ДНК ....................................................................................... 47
2.2.7 Молекулярное клонирование ....................................................................................... 47
2.2.8 ТА-клонирование ........................................................................................................... 48
2.2.9 Верификация конструкций ............................................................................................ 48
2.2.10 Измерение активности люциферазы .......................................................................... 49
2.2.11 Сверхэкспрессия в клетках микобактерий ................................................................. 50
2.2.12 Экспрессия и очистка белков...................................................................................... 51
2.2.13 Белковый электрофорез в полиакриламидном геле .................................................. 52
2.3 Конструирование генно-инженерных штаммов............................................................. 52
2.3.1 Список использованных плазмид.................................................................................. 52
2.3.2 Конструирование экспрессионных векторов системы pET........................................ 53
2.3.3 Конструирование микобактериальных экспрессионных плазмид pMind ................. 54
2.3.4 Создание микобактериальных репортерных слияний ................................................ 55
2.3.5 Нокаутирование генов микобактерий по методу Пэриш и Стокера.......................... 55
2.4 Биохимические методы ...................................................................................................... 56
2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография........................................................ 56
2.4.2 Определение активности алармонсинтетаз ................................................................. 56
2.4.3 Исследование цитотоксической активности ................................................................ 57
2.5 Биоинформатика и анализ данных.................................................................................. 58
2.5.1 Источники нуклеотидных и аминокислотных последовательностей,
трехмерных структур белков..................................................................................................... 58
2.5.2 Статистическая обработка и визуализация результатов ............................................. 58
2
2.5.3 Выравнивание аминокислотных последовательностей ............................................. 59
2.5.4 Молекулярный докинг ................................................................................................... 59
2.5.5 Виртуальный скрининг .................................................................................................. 60
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ............................................................................................ 61
3.1 Влияние фазы роста периодической культуры M. smegmatis на антибактериальную
активность DMNP в сравнении с традиционными антибиотиками ................................... 61
3.1.1 Зависимость характера кривых отмирания M. smegmatis от фазы роста
периодической культуры ........................................................................................................... 61
3.1.2 Зависимость антибактериальной активности DMNP и уровня экспрессии гена
relMsm от фазы роста периодической культуры........................................................................ 63
3.2 Эффективность воздействия изомерных форм DMNP в сравнении с рацематом .. 65
3.3 Алармонсинтетазы как мишени антибактериального действия DMNP.................. 66
3.3.1 Воздействие DMNP на штамм M. smegmatis со сверхэкспрессией длинного
RSH-белка RelMsm....................................................................................................................................................................................66
3.3.2 Воздействие DMNP на штамм со сверхэкспрессией малой алармонсинтетазы
RelZ 68
3.3.3 Воздействие витамина С, известного ингибитора алармонсинтетаз, на штамм
со сверхэкспрессией RelMsm .......................................................................................................................................................... 69
3.4 Оценка влияния DMNP на активность белков-мишеней in vitro............................... 70
3.4.1 Воздействие DMNP на активность длинного RSH-белка RelMsm................................................70
3.4.2 Воздействие DMNP на активность малой алармонсинтетазы RelZ........................... 72
3.4.3 Воздействие DMNP на активность длинного RSH-белка RelMtb..................................................73
3.5 Ферментативная кинетика алармонсинтетаз при добавлении DMNP ..................... 74
3.5.1 Кинетика длинного RSH-белка RelMsm................................................................................................................74
3.5.2 Кинетика малой алармонсинтетазы RelZ .................................................................... 77
3.6 Влияние DMNP на выживаемость штаммов с делециями генов relMsm и relZ ........ 78
3.7 Влияние DMNP на выживаемость штаммов с комплементацией нокаутов генов
relMsm и relZ...................................................................................................................................... 80
3.8 Моделирование взаимодействия DMNP с мишенями с использованием
молекулярного докинга................................................................................................................ 81
3.9 Виртуальный скрининг библиотеки структур производных DMNP ........................ 88
3.10 Усиление бактерицидного эффекта клинических антибиотиков за счет их
комбинации с DMNP..................................................................................................................... 90
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ................................................................................................. 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................................ 100
ВЫВОДЫ.......................................................................................................................................... 102
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ........................................................................................... 103
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ .......................................................... 104
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .................................................... 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................................ 106
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ...................................... 117
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Протоколы генетического конструирования ...................................................118
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Детализация результатов виртуального скрининга библиотеки структур
химических производных DMNP .................................................................................................... 128
