Введение
1. Проблемы в фотоаффинной модификации биополимеров при использовании ароматических азидов в качестве функциональных групп аффинных реагентов 8
1.1. Фотоаффинная модификация, и ее место в ряду других методов исследования надмолекулярных комплексов. Типы фотоактивируемых групп,Задача обзора 8
1.2 Проблемы, возникающие при интерпретации результатов экспериментов по фотоаффинной модификации биополимеров 10
1.2.1. Фотоактивируемые реагенты, содержащие азидогруппу в гетероциклическом основании 14
1.2.2. Фотоактивируемые реагенты на основе ароматических азидов 23
1.2.2.1. и-Нитрозамещённые арилазиды 35
1.2.2.2. Прочие арилазиды 38
1.3. Реакционная способность продуктов фотопревращения арилазидов в отношении функциональных групп биополимеров, или групп их имитирующих. 49
1.3.1. Азирины и азациклогептатетраены 49
1.3.2. Аминильные радикалы и радикалы амминия 50
1.3.3. Катионы арилнитрения 52
1.3.4 Нитрозооксиды, нитрозосоединения и гидроксиламины 54
1.3.5. Илиды 63
1.3.6. Производные /7-бензохинонмоно- и диимина. 64
2. Результаты и их обсуждения 69
2.1. Долгоживущие интермедиаты. ответственные за «темновые» процессы, протекающие при фотоаффинной модификации белков реагентами на. основе 5-азидо-2-нитробензойной кислоты 69
2.1.1. Синтез Лг-(5-азидо-2-нитробензоил)-Лг-((!-биотинил)-1,2- 70
диамиіюзтана(89)иЛг-(5-азидо-2-нитробензоил)-Лг-((і-биотинил)-1,3-диаминопропана (90)
2.1.2. Связывание фотоаналогов биотина и продуктов их фотолиза с лиганд- связывающим центром субъединиц стрептавидина 71
2.1.3. Фотовзаимодействие и вторичные реакции фотоактивируемьгх аналогов биотина (89) и (90) с активным центром стрептавидина 73
2.1.4. Фотопревращения фотоаналогов биотина (89) и (90) при облучении в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров 76
2.1.4.1. Механизм фотопревращения фотоаналога биотина (89) 77
2.1.5. Механизм фотопревращения «-нитрозамещенных арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров 82
2.1.5.1. Фотопревращения іУ-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3- диаминопропана (93) при облучении в водных растворах 82
2.1.5.2. Фотопревращение 4-нитрофенилазида (94) при облучении в водных растворах 86
2.2. Изучение продуктов фотовзаимодействия 5-азидо-2-нитро-бензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров 89
2.2.1. Анализ модифицированных пептидов. 90
2.2,2.. Фотоиндуцированное взаимодействие 5-азидо-2-нитробензоильной группы с функциональными группами Trp, His и Lys 92
2.2.2.1. Синтез 5-азидо-Лг-[2-(ЗН-имвдазол-4-ил)-зтил]-2- нитробензамида (104) и?/-{3-[2-амино-3-(Н-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5-азидо-2-нитробензамида(105) 93
2.2.2.2. Фотолиз 5-азидо-^У-[2-(ЗН-имидазол-4-ия)-этил]-2- нитробензамида (104) 93
2.2.2.3. Фотолиз ^-{З-р-амино-З^Н-индол-З-илї-пропиониламино]- пропил} -5-азидо-2-нитробензамида (105) 94
2.2.2.4. Сравнительный анализ результатов.по фотовзаимодействию 5- азидо-2-нитробензоильной- группы с функциональными-группами Trp, His, Lys и Туг [25] 99
3. Экспериментальная часть 101
3.2. Методы 101
3.3. Вычисление квантового выхода фотолиза соединений (89) и (105) 103
3.4. Ступенчатый фотолиз соединений (89) и (90) 104
3.5. Исследование соотношения продуктов фотолизаЛГ-(2-нитро-5- азидобещоил)-Г,3-диамйнодропана (93) 5-азидо-Лг-[2-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитро-бензамида (104) и Л^З-р-амино-З^Ш-индол-З-ил)-пропиониламино]~пропил} -5 -азидо-2 -нитробензамида (105) в зависимости от содержания кислорода в облучаемом растворе 104
3.6. Исследование взаимодействия продуктов фотолиза 4-нитрофенилазида (94) с 4-нитронитрозобензолом 104
3.7. Получение свободных оснований ЛЦг-нитро-З-азидобензоил)-!,2- диаминоэтана и Лг-(2-нитро-5-азидобензоил)-1,3-Диаминопропана (93) из соответствующих хлоргидратов 105
3.8. Идентификация продуктов фотолиза#-(5-азидо-2-нитробензоил)-1,3- диаминопропана (93) 105
3.9. Синтез Л^(2-нитро-5-азидо5ензокл)-//-((і-биотинил)-1,2-диаминозтана (89) и Лг-(2-нитро-5-азидобензоил)-Л-(сІ-биотинил)-1,3-диаминопропана (89) 106
3.10. Идентификация продуктов фотолизаіУ-(2-нитро-5-азидобензоил)-Лг-(сі- биотинил)-1,2-диаминоэтана (89) 107
3.11. Синтез 5-азидо-ЛЦ2-(ЗН-имидазол-4-ил)-этил]-2-нитро-бензамида(104) 108
З.12. Идентификация продуктов фотолиза (104) 108
3.13. Синтез Л/-{3-[2-амино-3-(Ш-индол-3-ил)-пропиониламино]-пропил}-5- азидо-2-нитробензамида (105) 109
3.14. Идентификация продуктов фотолиза арилазида (105) 110
3.15. Взаимодействие предоблучённых фотоаналогов биотина.(89) и (90) со стрептавидином и стрептавидин-биотиновым комплексом 111
3.16. .Фотомодификация стрептавидина фотоаналогами биотина на (89) и (90) 111
З.17. Ферментативный гидролиз фотомодифшщрованного стрептавидина 111
3.18. Анализ последовательности фотомодифицированных пептидов 112
Выводы 113
