Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Cтруктура хроматина и модификации гистонов 10
1.1.1. Ацетилирование гистонов 12
1.1.2. Метилирование гистонов 14
1.1.3. Распознавание модификаций гистонов 15
1.1.4. Гистоновый код 16
1.1.5. АТФ-зависимое ремоделирование хроматина 18
1.2. SWI/SNF комплексы, ремоделирующие хроматин 21
1.2.1. Состав SWI/SNF комплексов 21
1.2.2. Структура и механизм действия SWI/SNF комплексов 24
1.2.3. Функции SWI/SNF
1.2.3.1. Участие SWI/SNF в регуляции транскрипции на промоторах генов 26
1.2.3.2. Участие SWI/SNF в регуляции работы транскрипционных энхансеров 30
1.2.3.3. Участие SWI/SNF в репарации 34
1.2.3.4. Комплексы SWI/SNF и раковые заболевания 35
1.2.3.5. Роль SWI/SNF в развитии организма 36
1.2.4. Альтернативные субъединицы SWI/SNF комплексов 40
1.3. PHF10 и его гомологи 47
1.3.1. SAYP – гомолог PHF10 в D. melanogater 47
1.3.2. PHF10/BAF45a – субъединица комплекса SWI/SNF комплекса 48
2. Материалы и методы 51
2.1. Материалы, использованные в работе 51
2.1.1. Штаммы Escherichia coli и векторы, использованные в работе 51
2.1.2. Бактериальные среды 51
2.1.3. Клеточные линии 52
2.1.4. Ферменты и реактивы 52
2.1.5. Антитела 52
2.1.6. Хроматографическая система 53
2.1.7. Праймеры 53
2.2. Методы, использованные в работе 57
2.2.1. Работа с клетками 57
2.2.1.1. Трансфекция клеток линии HEK293 57
2.2.1.2. Получение стабильных линий 57
2.2.1.3. РНК-интерференция 57
2.2.1.4. Измерение пролиферативной емкости клеток. 58
2.2.1.5. Иммуноокрашивание клеток 58
2.2.2. Работа с нуклеиновыми кислотами 59
2.2.2.1. Приготовление компетентных клеток 59
2.2.2.2. Трансформация бактерий 59
2.2.2.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК 59
2.2.2.4. Обработка ферментами рестрикции 60
2.2.2.5. Лигирование 60
2.2.2.6. Гель-электрофорез ДНК 60
2.2.2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.2.2.8. Клонирование 61
2.2.2.9. Мутирование последовательности PHF10-S 62
2.2.2.10. Секвенирование ДНК 62
2.2.2.11. Выделение РНК 63
2.2.2.12. Получение кДНК 63
2.2.3. Работа с белками 63
2.2.3.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 63
2.2.3.2. Получение антител и их очистка 64
2.2.3.3. Получение белковых экстрактов из клеток 64
2.2.3.4. Осаждение белков антителами (иммунопреципитация) 65
2.2.3.5. Осаждение сумоилированных белков за His-тэг 65
2.2.3.6. Белковый гель-электрофорез 66
2.2.3.7. Вестерн-блот анализ 66
2.2.3.8. Гель-фильтрация белкового экстракта 66
2.2.3.9. Обработка ингибиторами протеасом, фосфатаз и фосфатазой фага Лямбда 67
2.2.3.10. Хроматиниммунопреципитация (ChIP) 67
3. Результаты 69
3.1. В клетках HEK293 PHF10 присутствует в виде многочисленных белковых изоформ 69
3.2. Открыты три новых мРНК гена PHF10 70
3.3. Четыре изоформы белка PHF10 71
3.4. Новые изоформы белка PHF10, не содержащие PHD домены, являются эволюционно консервативными 72
3.5. Изоформы PHF10 являются убиквитарными 74
3.6. Эндогенный белок PHF10 подвергается фосфорилированию 75
3.7. Белок PHF10 подвергается присоединению SUMO1 по PDSM мотиву 76
3.8. PHF10 является субъединицей комплексов PBAF и влияет на стабильность PBAF-специфичного модуля 78
3.9. PHF10-S и PHF10-P изоформы существуют на белковом уровне и входят в состав SWI/SNF комплекса на взаимоисключающей основе 80
3.10. Изоформы PHF10 включаются в состав SWI/SNF комплексов в фосфорилированном состоянии 82
3.11. PHF10-P изоформы, но не PHF10-S, контролируют пролиферацию клеток 84
3.12. Влияние PHF10-P- и PHF10-S-содержащих SWI/SNF комплексов на транскрипцию PHF10-зависимых генов 85
4. Обсуждение результатов 88
Заключение 91
Выводы 93
Список использованной литературы 94
Список использованных сокращений
