Введение
Глава 1. Обзор существующих подходов для диагностики состояния респираторной системы человека приминительно к социально значимым заболеваниям. Проблемы ранней диагностики заболеваний органов дыхания 13
1.1 Взаимосвязь состояния организма человека и показателей респираторной системы человека и обзор существующих методов мониторинга этих показателей 14
1.2 Проблемы ранней диагностики социально значимых заболеваний органов дыхания.. 20
Глава 2. Конденсат выдыхаемого воздуха человека: перспективы и проблемы для разработки метода ранней диагностики патологических изменений состояния организма 25
2.1 Состав конденсата выдыхаемого воздуха 25
2.2 Исследование газовой компоненты конденсата выдыхаемого воздуха и её диагностическая значимость 25
2.3 Исследование липидной компоненты конденсата выдыхаемого воздуха и её диагностическая значимость 26
2.4 Исследование белковой компоненты конденсата выдыхаемого воздуха и её диагностическая значимость 26
2.5 Протеом конденсата выдыхаемого воздуха в мультимодальных скрининговых программах 28
2.6 Методы сбора и определения белкового состава конденсата выдыхаемого воздуха 28
Экспериментальная часть 31
Глава 3. Материалы и методы 31
3.1 Материалы 31
3.2 Методы 32
3.2.1 Описание групп пациентов/доноров КВВ 32
3.2.2 Сбор и хранение проб КВВ 32
3.2.2.1 Система сбора Rube 32
3.2.2.2 Система сбора Eco-Screen 33
3.2.3 Пробоподготовка КВВ 34
3.2.3.1 Подготовка препарата КВВ для проведения хромато-масс-спектрометрического анализа (ВЭЖХ-МС/МС) 34
3.2.3.2 Обезжиривание и осаждение белков КВВ 34
3.2.3.3 Осаждение белков с помощью дезоксихолата натрия и трихлоруксусной кислоты.. 35
3.2.3.4 Концентрирование пептидов на колонке С18 (ZipTip C18) 35
3.2.4 Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС) проб КВВ 36
3.2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле 37
3.2.6 Гидролиз белков в ПААГ 37
3.2.7 Получение масс-спектров белков, сконцентрированных в ходе электрофореза 37
3.2.8 Биоинформатический анализ результатов 38
3.2.8.1 Создание реляционной базы данных проб КВВ 38
3.2.8.2 Анализ масс-листов с помощью Mascot 38
3.2.8.3 Анализ белков, с наибольшей вероятностью обнаруживаемых в пробе 39
3.2.8.4 Сопоставление пептидной и белковой выдачи программы Mascot 39
3.2.8.5 Анализ пептидов, с наибольшей вероятностью обнаруживаемых в пробе 40
3.2.9 Построение прогностических моделей на основании статистического анализа пептидного состава проб КВВ 40
Результаты и обсуждение 42
Глава 4. Особенности анализа масс-спектров белков КВВ 42
4.1 Принцип работы программы Mascot 42
4.2 Описание и выбор параметров программы Mascot в зависимости от эксперимента 44
4.2.1 Описание параметров программы Mascot 44
4.2.2 Выбор параметров программы Mascot 46
4.2.2.1 Параметры с неизменными значениями 46
4.2.2.2 Параметры с изменяемыми значениями 47
Глава 5. Основные свойства КВВ и методика пробоподготовки КВВ для анализа белкового состава, основанные на исследовании 17 молодых здоровых некурящих доноров 49
5.1 Основные свойства КВВ 49
5.2 Подбор оптимальной методики концентрирования белковых смесей для масс-спектрометрического определения/измерения 51
5.2.1 Чувствительность ВЭЖХ-МС/МС анализа 51
5.2.2 Оценка концентрации белка в КВВ 51
5.2.3 Сравнительный анализ методик концентрирования при пробоподготовке КВВ для масс-спектрометрического анализа 53
5.2.3.1 Лиофилизация 53
5.2.3.2 Осаждение белков ТХУ и концентрирование на колонке С18 54
5.2.3.3 Обессоливание и обезжиривание смесью метанол/хлороформ 56
5.2.4 Ограничения ферментативного гидролиза трипсином 57
5.3 Выводы главы 58
Глава 6. Исследование белкового состава КВВ здоровых доноров. Анализ кератинового фона окружающего воздуха, а также КВВ, собранных с помощью защитного фильтра 59
6.1 Исследование белкового состава КВВ здоровых доноров 59
6.2 Интерпретация белкового состава КВВ здоровых доноров с помощью MetaCore 60
6.3 Анализ белкового состава объединенной пробы конденсатов выдыхаемого воздуха здоровых доноров 61
6.4 Анализ кератинового фона окружающего воздуха, а также КВВ, собранных с помощью защитного фильтра 64
6.5 Выводы главы 65
Глава 7. Исследование белкового состава КВВ пациентов с ХОБЛ, пневмонией и раком легкого 68
7.1 Результаты анализа белкового состава КВВ пациентов с такими основными диагнозами, как ХОБЛ и внебольничная пневмония 68
7.2 Результаты анализа белкового состава КВВ больных с диагнозом «рак легкого» 78
7.3 Сравнительный анализ белкового состава КВВ больных с диагнозом «рак легкого» и белкового состава ткани, пораженной опухолевым процессом 84
7.4 Сравнительный анализ белкового состава КВВ больных с диагнозом «рак легкого» с уровнем экспрессии генов при данном заболевании 88
Глава 8. Новые подходы к разработке метода неинвазивной диагностики заболеваний легких на основе анализа состава КВВ 93
8.1 Создание базы данных проб и доноров КВВ 94
8.2 Анализ границ применимости программы Mascot при идентификации белкового и пептидного состава КВВ 95
8.3 Проблемы современного этапа развития метода и способы их решения 99
8.4 Метод классификации проб КВВ, основанный на пептидах 102
8.4.1 Формирование итоговых данных 102
8.4.2 Анализ масс-спектров промывочных заколов и проб на предмет загрязнения 102
8.4.3 Анализ идентифицированных пептидов в пробах КВВ, обработанных по предложенной в работе методике 105
8.5 Построение аналитичеких моделей, предсказывающих наличие фокусного заболевания у донора КВВ 112
8.6 Возврат на уровень белков при анализе пептидов по описанному методу 117
Основные результаты работы и выводы 119
Список литературы 121
Приложение 142
