Введение
Глава 1. Патофизиологические аспекты восстановления поврежденных желчных путей при использовании нативных и искусственных материалов (обзор литературы) 15
1.1 Современные проблемы восстановления поврежденных органов и тканей с помощью нативных и искусственных материалов 15
1.2. Особенности реконструкции и восстановления поврежденного желчного протока 18
1.3. Обеспечение механической проходимости желчных путей при помощи имплантатов 24
1.4. Использование биологически совместимых имплантатов при восстановлении поврежденного желчного протока 31
1.5. Обеспечение физиологической совместимости имплантируемых конструкций. Тканеинженерный желчный проток 34
1.6. Проблемы восстановления желчного протока с использованием различных нативных и искусственных материалов 42
1.6.1. Проблема выбора материала для изготовления имплантатов желчных путей 42
1.6.2. Проблема эпителизации нативных и искусственных трансплантатов 46
1.6.3. Проблема васкуляризации имплантированного материала 50
1.6.4. Проблемы тканевой инженерии функционализированных имплантатов для замещения поврежденных желчных путей 54
1.7. Проектирование ТИК для замещения поврежденных тканей и органов 63
Заключение по Главе 1 66
Глава 2. Материалы и методы 67
2.1. Общая характеристика экспериментальных материалов и методов исследования 67
2.2. Полимерные материалы, использованные для изготовления синтетических каркасов 67
2.3. Биологически активные соединения, использованные для модификации и визуализации структур волокнистых материалов 68
2.3.1. Зеленый флуоресцентный белок 68
2.3.2. Эпидермальный фактор роста 69
2.3.3. Генотерапевтический препарат “Неоваскулген” 69
2.4. Метод электроформования для изготовления полимерных материалов каркаса 70
2.4.1. Метод электроформования нетканого материала каркаса 70
2.4.2. Эмульсионное электроформование модифицированных полимерных материалов 71
2.4.3. Изготовление трубчатых каркасов методом электроформования 72
2.4.4. Изготовление непроницаемых для желчи трубчатых каркасов с использованием полимерной пленки 72
2.4.5. Получение трехслойных композитных каркасов тканеинженерной конструкции 73
2.5. Физико-механические методы оценки свойств нативных и искусственных материалов 75
2.5.1. Определение физических характеристик волокнистых каркасов 75
2.5.2. Определение механических характеристик нативных тканей и синтетических каркасов 76
2.5.3. Изучение проницаемости материалов для водных растворов 78
2.5.4. Изучение непроницаемости пленок в составе композитных каркасов 79
2.5.5. Исследование биодеградации материалов каркаса в различных средах 79
2.5.6. Исследование хирургической прошиваемости волокнистого материала каркасов 80
2.6. Получение и культивирование клеток, высеваемых на волокнистые каркасы 81
2.6.1. Получение и культивирование ММСК КМ 81
2.6.2. Получение и культивирование ЭКЖП 83
2.6.3. Культивирование клеток линии NIH/3T3 84
2.6.4. Культивирование клеток линии MCF-7 84
2.7. Заселение волокнистых каркасов ЭКЖП и ММСК КМ 85
2.7.1. Заселение внутренней поверхности каркасов эпителиальными клетками методом тканевого культивирования 85
2.7.2. Заселение внешней поверхности каркасов мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга 87
2.8. Морфологические и аналитические методы исследования 88
2.8.1. Световая микроскопия 88
2.8.2. Конфокальная микроскопия 88
2.8.3. Флуоресцентная микроскопия 88
2.8.4. Сканирующая электронная микроскопия 89
2.8.5. Гистологические и гистохимические методы исследования 89
2.8.6. Иммуноферментный анализ выхода EGF 90
2.8.7. Скрининг материалов на клеточных линиях MCF-7 и NIH/3T3 с применением МТТ-теста 90
2.8.8. Цитометрия в реальном времени с подсчетом клеточного индекса 92
2.9. Лабораторные животные 94
2.9.1. Мелкие лабораторные животные (крысы) 94
2.9.2. Крупное лабораторное животное (свинья) 96
2.10. Методы статистической обработки 97
Заключение по Главе 2 97
Глава 3. Результаты 99
3.1. Проектирование тканеинженерной конструкции желчного протока 99
3.1.1. Функциональный подход к проектированию ТИК желчного протока 99
3.1.2. Систематизация данных об анатомии, нормальной и патологической физиологии поврежденных желчных путей 100
3.1.3. Разработка функциональных требований к ТИК желчного протока 102
3.1.4. Выбор параметров васкуляризации ТИК желчного протока 104
3.1.5. Рациональный дизайн ТИК желчного протока 106
3.2. Выбор и оценка биосовместимости материалов для изготовления каркаса ТИК желчного протока 110
3.2.1. Создание волокнистых каркасов методом электроформования 111
3.2.2. Скрининговое исследование биосовместимости волокнистых образцов с использованием клеточных линий NIH/3T3 и MCF-7 111
3.2.3. Цитосовместимость волокнистых каркасов для ММСК КМ и ЭКЖП человека 115
3.2.4. Биологическая совместимость волокнистого поликапролактона для тканей мелких лабораторных животных 118
3.2.5. Тканеспецифичная совместимость каркаса из волокнистого поликапролактона на модели повреждения желчного протока свиньи 120
3.3. Физико-механические свойства нативных тканей и конструкций из волокнистых материалов 125
3.3.1. Механические свойства нативного желчного протока 126
3.3.2. Резорбция и механические свойства образцов одно- и многослойных волокнистых каркасов 127
3.3.3. Физико-механические свойства экспериментальных образцов тканеинженерной конструкции 132
3.4. Исследование материалов, модифицированных биологически активными соединениями 133
3.4.1. Модификация материалов биологически активными соединениями методом эмульсионного электроформования 133
3.4.2. Физико-механические свойства образцов волокнистых материалов, модифицированных биологически активными соединениями 135
3.4.3. Измерение выхода фактора роста EGF из волокнистого материала in vitro 137
3.4.4. Влияние волокнистого материала, модифицированного EGF, на пролиферацию клеток MCF-7 138
3.5. Резорбция образцов трубчатого каркаса в различных средах 140
3.6. Изучение активности прорастания сосудов в волокнистый поликапролактон, модифицированный препаратом “Неоваскулген”, при имплантации крысам в хроническом эксперименте 142
3.7. Оценка эффективности витализации многослойного каркаса ТИК клеточными культурами 1 3.7.1. Эпителиальные клетки желчного протока 148
3.7.2. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга 149
3.7.3. Двухслойное заселение волокнистых каркасов ТИК клеточными культурами 150
Заключение по Главе 3 153
Глава 4. Обсуждение 154
4.1. Достаточность использованных в работе материалов и методов для решения поставленных задач 154
4.2. Систематизация результатов реконструктивных и восстановительных операций на желчных путях 157
4.3. Свойства материалов каркаса ТИК желчного протока 158
4.4. Клеточная, тканевая и физиологическая совместимость волокнистых материалов 162
4.5. Ангиогенная модификация материала каркаса биологически активным соединением 164
4.6. Двухэтапная витализация биосовместимого многослойного волокнистого каркаса клеточными культурами 168
Заключение 173
Выводы 174
Благодарности 176
Список сокращений 177
Литература 179
