Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Генетическое разнообразие природных штаммов возбудителя холеры Эль Тор с атипичной структурой генов, связанных с вирулентностью и эпидемическим потенциалом. 14
1.2. Происхождение природных высокопатогенных геновариантов возбудителя холеры Эль Тор. 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1. Бактериальные штаммы, используемые в работе. 30
2.2. Питательные среды и реактивы. 32
2.3. Микробиологические методы: 32
2.3.1. Культивирование штаммов. 32
2.3.2. Определение продукции термолабильного гемолизина на плотной среде. 32
2.3.3. Определение подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы и фосфолипазы . 32
2.3.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов. 33
2.3.5. Определение вирулентности штаммов V. cholerae. 33
2.4. Биохимические методы: 34
2.4.1. Оценка продукции холерного токсина иммуноферментным методом GM1ELISA. 34
2.4.2. Двумерный электрофорез, изофокусирование, трипсинолиз белков, масс-спектрометрия и идентификация белков. 34
2.5. Молекулярно-генетические методы: 35
2.5.1. Выделение ДНК, ДНК гибридизация по Саузерну с молекулярным СТ-зондом. 35
2.5.2. Полимеразная цепная реакция с использованием специфичных олигонуклеотидных праймеров. з
2.5.3. Определение нуклеотидной последовательности различных генов. 39
ГЛАВА 3. Выявление и молекулярно-генетический анализ природных геновариантов vibrio cholerae биовара эльтор с измененной структурой генов пандемичности и патогенности, выделенных на территории российской федерации 40
3.1. Сравнительный анализ генетической организации острова пандемичности VSP-II у типичных и генетически измененных штаммов
возбудителя текущей пандемии холеры, изолированных на территории РФ. 41
3.2. Изучение структуры острова патогенности VPI-1 у геновариантов с делецией ряда генов острова пандемичности VSP-II . 46
ГЛАВА 4. Конструирование диагностической пцр тест системы для дифференциации геновариантов с различным эпидемическим потенциалом на основе различий в структуре их острова пандемичности VSP-II 55
4.1. Выбор генов-мишеней и расчет праймеров. 55
4.2. Подбор оптимальных условий проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции. 58
4.3. Разработка набора реагентов для проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов для определения эпидемического потенциала генетически измененных штаммов на основе структуры VSP-II . 59
4.4. Изучение специфичности и эффективности разработанной мультиплексной ПЦР тест-системы. 64
4.5. Лабораторные испытания разработанной мультилокусной ПЦР тест системы. 68
ГЛАВА 5. Алгоритм расширенной идентификации генетически измененных штаммов vibrio cholerae биовара эль ТОР 73
5.1. Разработка алгоритма расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. 75
5.2. Оценка эффективности разработанного алгоритма расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль
Тор. 80
ГЛАВА 6. Экспериментальное моделирование образования геновариантов в процессе конъюгации и изучение их фенотипических и молекулярно-генетических свойств 90
6.1. Экспериментальное получение геновариантов возбудителя холеры Эль Тор, несущих ген ctxB1 холерных классических вибрионов. 91
6.2. Сравнительный анализ вирулентных свойств реципиентного штамма V. cholerae М818 биовара Эль Тор и рекомбинантов с повышенной экспрессией ключевых и дополнительных факторов вирулентности. 98
6.3. Молекулярно-генетический анализ экспериментально полученных геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной продукцией СТ. 99
6.4. Сравнительный протеомный анализ реципиентного штамма V. cholerae М818 и экспериментально полученного геноварианта с гиперпродукцией СТ. 102
Заключение 109
Выводы 115
Список использованных источников 11
