Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. История изучения нейробластомы 10
1.2. Общая характеристика нейробластомы 11
1.3. Клинические стадии нейробластомы 13
1.4. Гистологическое строение нейробластомы 14
1.5. Факторы, определяющие прогноз заболевания 17
1.6. Характеристика и функции гена MYCN 19
1.7. Амплификация гена MYCN 19
1.7.1. Определение понятия. Особенности при нейробластоме 19
1.7.2. Методы определения статуса гена MYCN 22
1.7.3. Гетерогенность амплификации гена MYCN 23
1.7.4. Механизм формирования амплификации 24
1.7.5. Типы амплификации гена MYCN и их прогностическое значение при нейробластоме. Элиминация амплифицированных последовательностей 26
1.8. Хромосомные аберрации при нейробластоме 28
1.9. Метод первичных тканевых культур 30
1.10. Белок CRABP1 и его роль в процессе дифференцировки 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) на мазках-отпечатках опухоли 35
2.2. Метод FISH на парафиновых срезах 36
2.2.1. FISH на парафиновом срезе – стандартная методика (обработка 1М изотиоцианатом натрия) 36
2.2.2. FISH на парафиновом срезе – использование высокого давления 38
2.2.3. Оценка результатов FISH-реакции 40
2.3. Метод первичных тканевых культур 41
2.3.1. Получение фиксированного in situ материала опухолевых клеток на слайд-флаконах 41
2.3.2. Методика культивирования клеток нейробластомы in vitro 42
2.3.3. Получение фиксированного материала опухолевых клеток при культивировании Flask-методом для цитогенетического исследования 43
2.3.4. Процедура FISH для культивированных опухолевых клеток 45
2.4. Определение экспрессии белка CRABP1 46
2.4.1. Метод иммуногистохимии 46
2.5. Методы статистического анализа данных 46
Глава 3. Результаты 47
3. Исследование статуса гена MYCN 47
3.1. Оценка результатов FISH-реакции на мазках-отпечатках нейробластомы 47
3.1.1. Центромерные сигналы 2 хромосомы 49
3.1.2. Варианты распределения сигналов гена MYCN и центромерных сигналов на мазках-отпечатках нейробластомы 50
3.1.3. Преимущество использования мазков-отпечатков 52
3.2. Оценка результатов FISH-реакции на парафиновых срезах нейробластомы 53
3.2.1. Центромерные сигналы 2 хромосомы 55
3.2.2. Варианты распределения сигналов гена MYCN и центромерных сигналов на парафиновых срезах нейробластомы 55
3.3. Амплификация гена MYCN на мазках-отпечатках и парафиновых срезах нейробластомы 56
3.3.1. Амплификация в виде двойных ацентрических хромосом (double minute – dmin). Образование микроядер 56
3.3.2. Амплификация в виде гомогенно окрашенных регионов (homogenously staining regions – HSR) 60
3.3.3. Гетерогенный (смешанный) тип амплификации гена MYCN 61
3.4. Определение статуса гена MYCN у пациентов в динамике 63
3.5. Определение статуса гена MYCN у пациентов с другими опухолями 64
4. Культивирование клеток нейробластомы 65
4.1. Получение первичных тканевых культур на слайд-флаконах 66
4.2. Клеточный состав нейробластом 66
4.3. Культурально-морфологические характеристики полученных тканевых культур 70
4.4. Стадии развития первичных тканевых культур и их клеточный состав 71
4.5. Сопоставление клеточного состава тканевой культуры с микроструктурой нейробластомы, из которой она была получена 74
4.6. Сопоставление клеточного состава тканевой культуры с эффективностью проведенного лечения (2 случая) 76
4.7. Использование метода FISH для определения статуса протоонкогена MYCN в геномах культивированных клеток нейробластомы 77
5. Экспрессия белка CRABP1 в нейробластомах 83
5.1. Изучение экспрессии белка CRABP 1 в образцах нейробластомы разной степени дифференцировки и с различными генетическими нарушениями 83
5.2. Изменение экспрессии белка CRABP 1 в процессе терапии нейробластомы 90
Глава 4. Обсуждение результатов 96
Заключение 108
Выводы 109
Список сокращений 110
Список использованной литературы 111
