Введение
Обзор литературы 7
1.1 Синаптическая передача электрического сигнала и её регуляция 7
1.1.1 Молекулярные основы синаптической передачи 7
1.1.2 Синаптические структуры как самостоятельные клеточные компартменты 11
1.2 Регуляция pH в нейронах и его влияние на синаптическую проводимость 12
1.2.1 Влияние электрической активности на pH в нейронах 12
1.2.2 Регуляция pH в мозге 15
1.2.3 Влияние цитоплазматического pH на синаптическую активность. 17
1.3 Активные формы кислорода и их роль в функционировании нейронов 19
1.3.1 Биология активных форм кислорода 19
1.3.2 Источники активных форм кислорода в нейронах 22
1.3.3 Антиоксидантные системы нейронов 29
1.3.4 Влияние активных форм кислорода на синаптическую активность нейронов 32
1.3.5 Участие активных форм кислорода в развитии нейродегенеративных заболеваний 35
1.4 Способы регистрации и модуляции метаболической и электрической активности в
нейронах 40
1.4.1 Способы мониторинга pH в нейронах 40
1.4.2 Детекция уровня активных форм кислорода в нейронах 44
1.4.3 Система для направленной продукции пероксида водорода 46
Материалы и методы 50
2.1 Материалы 50
2.1.1 ДНК-Вектора 50
2.1.2 Реактивы и расходные материалы для клонирования 50
2.1.3 Оборудование и программное обеспечение для клонирования 50
2.1.4 Эукариотические клеточные линии, культуральные среды и расходные материалы 51
2.1.5 Оборудование для работы с клеточными линиями 51
2.1.6 Оборудование и програмное обеспечение для имаджинга 52
2.1.7 Использованные для имаджинга химические вещества 52
2.2 Методы 52
2.2.1 Получение генетических конструкций 52
2.2.2 Культивирование и трансфекция клеточных линий HeLa и NIH/3T3 54
2.2.3 Выделение и трансфекция первичной эмбриональной культуры гипокампальных нейронов 54
2.2.4 Флуоресцентная микроскопия 56
2.2.5 Калибрование индикаторов по pH 56
2.2.6 Компьютерная обработка изображений 57
Результаты и обсуждение 59
3.1 Регистрация динамики pH в нейронах. 59
3.1.1 Разработка генетически кодируемого индикатора с повышенной яркостью в клетках 59
3.1.2 Характеристика динамики значения цитоплазматического pH в диссоциированной культуре нейронов. 62
3.1.3 DPI вызывает закисление цитоплазмы нейронов 67
3.1.4 Получение синаптических конструкций с SypHer2 69
3.1.5 Экспрессия SypHer2 в короткоживущих срезах мозга мыши 72
3.2 Система для контролируемой локальной продукции пероксида водорода 74
3.2.1 Оксидаза D-аминокислот может продуцировать пероксид водорода в ответ на добавление D-аланина к клеткам 74
3.2.2 Продукция пероксида водорода в нейронах 78
Выводы 82
Заключение 83
Список сокращений 86
Список литературы 89
