Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Формирование репертуаров Т-клеточных рецепторов 10
2.1.1. Белковая структура Т-клеточного рецептора и основных корецепторных молекул 10
2.1.2. Распознавание антигена Т-клеточным рецептором 12
2.1.3. Сборка гена Т-клеточного рецептора 14
2.1.4. Механистическая модель сборки Т-клеточного рецептора 17
2.1.5. Позитивная и негативная селекция Т-лимфоцитов 19
2.2. Изучение репертуаров Т-клеточных рецепторов с помощью высокопроизводительного секвенирования 21
2.2.1. Статистики распределения частот клонотипов 24
2.2.2. Изучение клональной динамики 26
2.2.3. Изучение распределения клонотипов в пространстве 26
2.2.4. Поиск одинаковых клонотипов у группы доноров 27
2.2.5. Изучение особенностей первичной структуры TCR 28
2.3. Вирус желтой лихорадки 29
2.3.1. Вакцина от вируса желтой лихорадки 30
2.4. Адаптивный иммунный ответ на первичную вакцинацию от вируса желтой лихорадки 31
2.4.1 Динамика клеточного ответа на вирус желтой лихорадки 31
2.4.2. Состав клеточного иммунного ответа на вирус желтой лихорадки 33
2.4.3. Образование Т-клеток памяти после вакцинации от желтой лихорадки 35
2.4.4. Использование методов высокопроизводительного секвенирования для изучения Т-клеточного ответа на вирус желтой лихорадки 36
2.4.5. Иммунный ответ на ревакцинацию от желтой лихорадки 38
3. Материалы и методы 39
3.1. Материалы 39
3.1.1. Использованное оборудование и расходные материалы 39
3.1.2. Использованные реактивы 39
3.1.3. Буферные растворы 40
3.2. Методы 41
3.2.1. Доноры и образцы крови 41
3.2.2. Выделение тотальной фракции РВМС 41
3.2.3. Выделение CD4 и CD8 Т-клеток 42
3.2.4. Выделение субпопуляций Т-клеток памяти 42
3.2.5. Выделение CD8 Т-клеток, специфичных к иммунодоминантному эпитопу вируса желтой лихорадки 43
3.2.6. Выделение РНК 44
3.2.7. Определение HLA-генотипов доноров 45
3.2.8. Приготовление библиотек кДНК и -цепей TCR 46
3.2.9. Секвенирование тотальной мРНК (RNAseq) 49
3.2.10. Секвенирование транскриптома и TCR репертуаров единичных клеток 49
3.2.11. Электрофорез и вырезание библиотек из геля 50
3.2.12. Очистка кДНК и ПЦР продуктов на колонках 50
3.2.13. Очистка на магнитных частицах 51
3.2.14. Первичная обработка результатов секвенирования 51
3.2.15. Анализ данных секвенирования 51
4. Результаты и обсуждение 53
4.1. Разработка метода HLA-типирования на основе РНК 53
4.1.1. Разработка системы пробоподготовки библиотек кДНК генов HLА 53
4.1.2. Разработка алгоритма анализа данных секвенирования для HLA-типирования 55
4.2. Мониторинг Т-клеточного иммунного ответа на первичную и вторичную вакцинацию от желтой лихорадки 58
4.2.1. Создание коллекции образцов и секвенирование библиотек кДНК TCR 58
4.2.2. Динамика ответа на первичную и вторичную вакцинацию 59
4.2.3. Ответ CD4 и CD8 клонов на вакцинацию от желтой лихорадки 60
4.2.4. Вторичная вакцинация от желтой лихорадки через 30 лет после первичной 62
4.2.5. Индивидуальная динамика ЖЛ-реактивных клонотипов 63
4.2.6. Слежение за индивидуальными клонотипами после первичной вакцинации 65
4.2.7. Идентификация изменившихся клонов на основе индивидуальных клональных траекторий 67
4.2.8. Спаривание и -цепей TCR на основе клональных траекторий 68
4.2.9. Изменение клеточного фенотипа в ходе вакцинации от желтой лихорадки 70
4.2.10. Сила иммунного ответа на иммунодоминантный эпитоп вируса желтой лихорадки 72
4.2.11. Анализ характеристических аминокислотных последовательностей TCR, специфичных к иммунодоминантному эпитопу вируса желтой лихорадки 75
4.2.12. Анализ парного TCR репертуара клонов, специфичных к иммунодоминантному эпитопу вируса желтой лихорадки 76
4.2.13. Структурное моделирование TCR, специфичных к иммунодоминантному эпитопу вируса желтой лихорадки 79
4.2.14. Анализ фенотипического разнообразия Ш4В2і4-222-специфических клеток через 1.5 года после вакцинации от желтой лихорадки 81
4.2.15. Анализ распределения клонов Т-клеток между фенотипами 85
4.3. Использование особенностей аминокислотных последовательностей TCR для идентификации ЖЛ-реактивных клонов 88
5. Заключение 93
6. Выводы 94
7. Благодарности 95
8. Список сокращений 96
9. Список литературы 97
Приложения 106
Приложение 1 106
Приложение 2 109
