Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 27
1.1. Белки BRCA1 и BRCA2 27
1.1.1. История открытия 27
1.1.2. Структурно-функциональная организация белка, кодируемого геном BRCA1 28
1.1.3. Структурно-функциональная организация белка, кодируемого геном BRCA2 37
1.2. Наследственные формы РМЖ, не связанные с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 42
1.2.1. Вклад мутаций в гене CHEK2 в формирование наследственных форм РМЖ 42
1.2.2. Наследственные формы РМЖ, не связанные с мутациями в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2 46
1.3. Методы анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 52
1.4. Необходимость анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 для ранней диагностики и выбора корректного лечения 59
1.5. Молекулярно-генетический анализ в онкологии с использованием массового параллельного секвенирования 66
1.6. «Молекулярные портреты» опухолей при РМЖ 70
1.7. Амплификация генов при РМЖ 76
1.8. Воздействие химиотерапевтических препаратов на опухоли с гиперэкспрессией HER2/neu 83
1.9. Новые препараты, используемые для лечения пациентов с HER2-позитивным РМЖ 89
1.9.1. Лапатиниб 89
1.9.2. Разработка новых препаратов, направленных на лечение HER2-позитивного РМЖ
1.10. Технологии анализа HER2 статуса опухоли 92
1.10.1. Метод иммуногистохимического анализа (IHC) 92
1.10.2. Метод флуоресцентной гибридизации (FISH) 95
1.10.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 97
ГЛАВА 2. Материалы 100
2.1. Образцы, используемые в исследовании 100
2.1.1. Популяционная выборка 100
2.1.2. Выборка пациентов с диагнозом «РМЖ» 100
2.1.3. Образцы опухолей 101
2.2. Реактивы 102
2.3. Плазмидные ДНК, штаммы E. сoli 104
ГЛАВА 3. Методы 105
3.1. Выделение геномной ДНК 105
3.2. Выделение ДНК из архивных и свежезамороженных образцов ткани опухоли РМЖ 105
3.3. Приготовление пулов ДНК 106
3.4. ПЦР в режиме реального времени 106
3.5. Определение концентрации растворов ДНК с помощью калибровочной прямой с использованием ПЦР в режиме реального времени... 107
3.6. Обработка результатов 108
3.7. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности 109
3.8. Аллель-специфичная ПЦР в режиме реального времени 110
3.9. Вставка чужеродных фрагментов ДНК в ген щелочной фосфатазы E. сoli между кодонами Gln253 и Lys254 112
3.10. Вставка чужеродных фрагментов ДНК в ген щелочной фосфатазы E. coli между кодонами Ala218 и Gly219 113
3.11. Конструирование плазмиды pPhoA-frame 115
3.12. Трансформация и анализ рекомбинантных плазмидных ДНК 116
3.13. Трансформация, выделение и анализ плазмидных ДНК 117
3.14. Амплификация фрагментов гена BRCA1 118
3.15. Клонирование амплифицированных фрагментов гена BRCA1 119
3.16. Определение бета-галактозидазной активности 119
3.17. Определение активности щелочной фосфатазы in situ 120
3.18. Статистическая обработка данных 120
Глава 4. Результаты и обсуждение 122
4.1. Разработка методов анализа мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 123
4.1.1. Разработка метода анализа целостности рамки трансляции с использованием клонирования исследуемого фрагмента в рамку с геном-репортером LacZ 123
4.1.2. Анализ возможности встройки чужеродных полипептидов в молекулу щелочной фосфатазы E. coli 134
4.1.2.1. Встройка чужеродных пептидов после Ala218 щелочной фосфатазы 147
4.1.2.2. Оценка ферментативной активности модифицированных щелочных фосфатаз 150
4.1.3. Конструирование плазмиды pPhoA-frame 152
4.2. Разработка метода анализа мутаций с использованием пулированных образцов 162
4.3. Частоты встречаемости мутаций в популяции и среди больных РМЖ 170
4.4. Молекулярно-генетический анализ опухолевых клеток при РМЖ 177
4.4.1. Разработка метода анализа амплификации гена HER2/neu с использованием ПЦР в режиме реального времени 180
4.4.2. Сравнение результатов определения дозы гена HER2/neu предложенным протоколом TaqMan ПЦР в реальном времени с результатами ИГХ и FISH определения HER2-статуса опухолей РМЖ 185
4.4.3. Выявление вариантов HER2/neu-содержащих ампликонов в клетках опухолей при РМЖ методом ПЦР в реальном времени .188
4.4.4. Анализ флексибильности ДНК в районе MED1 – HER2/neu – TOP2A .191
4.4.5. Флексибильные последовательности в генах IKZF3 и RARA, способные формировать устойчивые вторичные структуры 193
4.4.6. Различный уровень амплификации вокруг сайтов высокой флексибильности FlexIKZF3-1082 и FlexIKZF3-225 и FlexRARA 195
4.4.7. Обсуждение результатов анализа амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген HER2/neu 197
Заключение 202
Выводы 206
Список литературы 209
