Введение
1. ДНК- и РНК-полимсразы: структурно-функциональное разнообразие и елипын каталитический механизм (литературный обзор). 9
1.1. Пространственная структура односубъсдиничных нуклсотид-полимсраз. 11
1.2. Структура активного центра и связывание субстратов. 20
1.2.1. Структурные мотивы. 20
1.2.2. Связывание матрицы/праймера. 23
1.2.3. Связывание нуклеозидтрифосфатов. 31
1.3. Катализ полимеразной реакции. 41
1.3.1. Ионы металла в активном центре полимеразы. 44
1.3.2. Конформациоппыс изменения полимсраз при связывании субстратов. 47
1.3.3. Процсссивность полимсраз. 52
2 Материалы и методы. 56
1.1.. Материалы. 56
1.1.1. Ферменты. 56
2 Реактивы. 56
2.1.2.Нуклеозиды, нуклеотиды и их производные. 57
2. 1.4. Среды для культивирования клеток E.coli. 57
2.1.5. Плазмиды, использованные в работе. 57
2.2. Методы. 59
2.2.1. Выделение и очистка Т7 РНКП и еЄ мутантной формы (Тугб39Рпе, Scr641A!a Т7 РИКП). 59
2.2.2. Выделение обратной транскритазы ВИЧ-І и се мутантных форм. 60
2.2.3. Электрофорез белков. 61
2.2.4. Препаративное выделение плазмидной ДНК. 61
2.2.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 62
2.2.6. Транскрипция in vitro. Получение смешанных полинуклсотидов. 62
2.2.7. Электрофорез образцов нуклеиновых кислот в ПАЛҐ. 63
2.2.8. Электрофорез образцов в агарозном геле. Элюция из геля. 64
2.2.9. Определение эффективности иолимеразной реакции. 65
2.2.І0. РНК/РНК-полимеразная реакция, катализируемая формы Tyr639Phc, Ser641AlaT7 РНКП. 65
2.2.11. Реакция обратной транскрипции. 66
2.2.12. Получение [32Р]-меченых ДНК и олигонуклеотидов. 66
2.2.13. Ссквенирование РНК и СПН. 66
2.2.14. Получение активированной ДНК. 67
2.2.15. Определение констант ингибирования аналогами пирофосфата и нуклеотидов. 67
2.2.16. Включение модифицированных rNTP в РНК-продукт реакции Т7 РНКП. 68
2.З. Построение пространственных моделей. 68
2.3.1. Моделирование связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ. 68
2.3.2. Моделирование связывания аналогов в активном центре Т7 РНКП. 69
3. Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК- иолнмеразой бактериофага Т7 и обратной транскиптазой ВИЧ-1. (обсуждение результатов) 70
3.1. Синтез смешанных рибо/дезоксирибополинуклеотидов мутаитной формой Т7 РНКП. 71
3.2. Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1. 83
3.З. Исследование взаимодействия ОТ ВИЧ-1 с модифицированными прайм срами, содержащими 2-0-(Р-В-рибофуранозил)аденозин. 92
3.4. Взаимодействие ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП с фосфонатными аналогами NTP и неорганического пирофосфата. 101
4. Выводы. 116
