Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Применение дейтерированных соединений и методы их получения 8
1.1.1. Применение дейтерированных соединений 8
1.1.2. Методы получения дейтерированных БАС 11
1.2.Влияние оксида дейтерия на рост, биохимию и физиологию микроорганизмов 13
1.2.1. Сравнительный анализ физико-химических свойств НгО и 2НгО 13
1.2.2. Влияние НгО на рост и морфологию микроорганизмов, феномен клеточной адаптации к 2НгО 15
1.2.3. Влияние НгО на скорость ферментативных реакций и метаболизм углерода 18
1.2.4. Влияние 2НгО на метаболизм нуклеиновых кислот, экспрессию генов и генетический контроль 19
1.2.5. Влияние НгО на физиологию микроорганизмов 20
1.3. Связь клеточного ответа на НгО и другие стрессовые факторы 20
1.3.1. Перекрестная адаптация к стрессам у микроорганизмов 21
1.3.2. Участие экзометаболитов (внеклеточных факторов) в адаптации клетки к стрессам 22
1.4. Метилотрофные бактерии как объекты изотопной биотехнологии 23
1.4.1 Основные свойства метилотрофных бактерий 24
1.4.1.1. Особенности метилотрофных бактерий 24
1.4.1.2. Характеристика первого и ключевого фермента ассимиляции метанола у ^. метилотрофных бактерии - метанолдегидрогеназы 24
1.4.2. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий 28
1.4.2.1. Экзополисахариды метилотрофных бактерий 29
1.4.4.2. Генетическое исследование метилотрофных бактерий 30
1.4.3. Получение дейтерированных БАС с использованием метилотрофных бактерий.,31
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
2.1. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741 35
2.1.1. Определение кинетических параметров роста Methylophilus sp. В-7741 в средах различного изотопного состава 36
2.1.2. Влияние содержания дейтерометанола в субстрате на рост Methylophilus sp. В-7741 42
2.1.3. Влияние ступенчатой адаптации бактерий Methylophilus sp. В-7741 к 2Н20-
содержащим средам на продолжительность лаг-фазы, цтах иУ^ 42
2.1.4. Определение оптимальных условий - температуры и рН (р2Н) - для
роста бактерий Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированных средах 45
2.2. Оксид дейтерия как стрессовый фактор у Methylophilus sp. В-7741 47
2.2.1. Влияние условий выращивания посевного материала на параметры роста в дейтерированной среде 47
2.2.2. Определение активности каталазы в клетках, выращенных в обычной и дейтерированной среде 50.
2.2.3. Изучение биологического действия дейтерированной бесклеточной жидкости на рост Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированной среде 54
2.3. Влияние дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741 56
2.3.1. Активность МДГ в экстракте Н и 2Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741 59
2.3.2. Изучение изотопного эффекта субстрата в реакции, катализируемой
МДГ Methylophilus sp. В-7741 60
2.3.3. Изучение изотопного эффекта растворителя в реакции, катализируемой МДГ Methylophilus sp. В-7741 61
2.3.4. Изучение влияния рН на активность МДГ в экстракте Н и Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741 62
2.4. Влияние дейтерия на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741 62
2.4.1. Влияние питательных сред с разными уровнями содержания
дейтерия на биосинтез ЭПС 63
2.4.2. Влияние температуры и рН на биосинтез ЭПС в *Н- и 2Н-среде 64.
2.5. Исследование углеводного состава ЭПС и определение степени включения дейтерия в ЭПС 68
2.5.1. Выделение и очистка ЭПС Methylophilus sp. В-7741 68
2.5.2. Гидролиз ЭПС Methylophilus sp. В-7741 и определение углеводного состава гидролизата хроматографическими методами 70
2.5.3. Изучение углеводного состава гидролизата ЭПС
Methylophilus sp. В-7741 методом Н и 13С-ЯМР спектроскопии 72
2.5.4. Определение степени включения дейтерия в ЭПС при выращивании
Methylophilus sp. В-7741 в максимально дейтерированной среде 72
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 76
3.1. Материалы 76
3.1.1. Микробиологический объект 76
3.1.2. Реагенты 76
3.1.3. Приборы 77
3.1.4. Питательные среды для культивирования Methylophilus sp. В-7741 77
3.2. Методы 77
3.2.1. Культивирование бактерий Methylophilus sp. В-7741 78
3.2.2. Ступенчатая адаптация бактерий Methylophilus sp. В-7741 к средам, приготовленным на основе 2НгО 79
3.2.3. Приготовление посевного материала, адаптированного к осмотическому и окислительному стрессу 79
3.2.4. Определение ростовых параметров 80
3.2.5. Получение бесклеточных КЖ 80
3.2.6. Определение концентрации экзополисахарида 80
3.2.7. Приготовление клеточного экстракта из Н- и Н-биомассы 81
3.2.8. Определение содержания белка в клеточных экстрактах по методу Лоури 81
3.2.9. Определение активности каталазы 82
3.2.10. Определение активности МДГ 82
3.2.11. Частичный гидролиз в 0,1 нТФУ 82
3.2.12. Полный гидролиз в 2 нТФУ 83
3.2.13. Получение 1,2,3,4,6-пента-0-ацетил-р-Б-глюкопиранозы 83
3.2.14. Ацетилирование гидролизата дейтерированного ЭПС 83
3.2.14. Анализ состава гидролизатов методом ТСХ, БХ, и ВЭЖХ 84
ВЫВОДЫ 85
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 86
