Введение
Глава 1. Перспективы поиска, создания и доклинического изучения ферментных противоопухолевых препаратов. Обзор литературы 16
1.1. Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот 16
1.1.1. L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1.) 16
1.1.2. L-аргининдеиминаза (КФ 3.5.3.6.) 22
1.1.3. L-метионин-у-лиаза (КФ 4.4.1.11.) 25
1.1.4. Оксидазы L-аминокислот 26
1.1.5. Ь-фенилаланин:аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.5) 29
1.1.6. Тирозин-фенол-лиаза(КФ 4.1.99.2) 30
1.2. Рибонуклеазы 30
1.2.1. Ранпирназа (онконаза) 30
1.2.2. Амфиназа 31
1.2.3. Биназа 32
1.3. Современные подходы к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых
ферментов 32
1.3.1. Поиск перспективных субстанций 32
1.3.2. Разработка методов выделения субстанции в препаративном количестве 33
1.3.3. Оценка физико-химических и кинетических свойств ферментов 36
1.3.4. Оценка антипролиферативной активности ферментов 37
1.3.5. Поиск способов оптимизации терапевтических характеристик 40
1.3.6. Оценка элементов фармакокинетики 42
1.4. Актуальность разработки новых подходов к поиску и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов 43
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Изученные ферменты и их источники 46
2.2. Реактивы 47
2.3. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов 47
2.4. Наработка биомассы и очистка L-аспарагиназ 49
2.5. Определение ферментативной активности 49
2.6. Определение физико-химических свойств 50
2.7. Исследования зависимости «структура-функция» 51
2.8. Оценка цитотоксичности 52
2.9. Оценка специфической противоопухолевой активности
2.10. Оценка токсичности 57
2.11. Оценка элементов фармакокинетики 58
2.12. Оценка иммуногенности 60
2.13. Статистическая обработка 62
Глава 3. Экспериментальные подходы к созданию и отбору продуцентов ферментов 64
3.1. Новый метод отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ 64
3.2. Создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов L-аспарагиназ
3.2.1. Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis 69
3.2.2. Создание штамма продуцента L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum 73
3.2.3. Создание продуцентов мутантных форм L-аспарагиназы i?. rubrum 75
3.3. Выделение и очистка полученных L-аспарагиназ 76
3.3.1. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы Y. pseudotuberculosis 76
3.3.2. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы i?. rubrum 77
Глава 4. Физико-химические и кинетические характеристики полученных ферментов 81
4.1. Оптимальные условия протекания ферментативных реакций 81
4.1.1. Оптимумы рН и температуры новых L-аспарагиназ 81
4.2. Чувствительность к химической и температурной денатурации 85
4.2.1. Стабильность полученных L-аспарагиназ 85
4.3. Кинетические параметры полученных L-аспарагиназ 87
Глава 5. Отдельные биологические характеристики полученных ферментов 91
5.1. Антигенные свойства и перекрестная иммуногенность новых L-аспарагиназ 91
5.1.1. IgG-иммунный ответ 91
5.1.2. IgM-иммунный ответ 91
5.1.3. Перекрестная иммуногенность L-аспарагиназ 92
5.2. Основные фармакокинетические параметры 94
5.2.1. Элементы фармакокинетша -лизин-а-оксидазы у мышей 94
5.2.2. Прогнозирование фармакокинетических параметров L-лизин-а-оксидазы у человека 96
5.2.3. Элементы фармакокинетики L-метионин-у-лиаз у мышей 97
5.2.4. Стабильность L-метионин-у-лиаз в плазме крови человека 98
Глава 6. Прескрининг на культурах опухолевых клеток новых ферментов различной природы
100
6.1. Цитотоксичность новых L-аспарагиназ 100
6.2. Цитотоксичность L-метионин-у-лиаз из новых источников 105
6.3. Цитотоксичность L-фeнилaлaнин:aммиaк-лиaзыі?/гой?о рог/ й?шда toruloides 106
6.4. Цитотоксичность L-лизин-альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai 107
6.5. Цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius 108
6.1.6. Отбор ферментов на основании данных прескрининга 108
Глава 7. Противоопухолевая активность новых ферментов различной природы и механизма действия 110
7.1. Скрининг противоопухолевой активности отобранных ферментов 110
7.1.1. Скрининг и диапазон терапевтических доз новых L-аспарагиназ 110
7.1.2. Оценка антипролиферативной активности in vivo L emir aHHH:aMMHaK Ha3bi... 115
7.1.3. Оптимизация схемы внутривенного введения противоопухолевого фермента L-лизин-альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai 116
7.1.4. Спектр чувствительных опухолей к L-лизин-альфа-оксидазе Trichoderma cf. aureoviride Rifai 120
7.1.5. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius 123
7.2. Доклиническое изучение новых ферментов на подкожных ксенографтах опухолей
человека у иммунодефицитных мышей 124
7.2.1. Спектр противоопухолевой активности L-лизин-альфа-оксидазы 124
7.2.2. Противоопухолевая активность иммуноРНКазы 4D5 scFv-дибарназы 126
7.2.3. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) 130
7.3. Разработка модели для доклинической оценки противоопухолевого эффекта L-метионин у-лиаз 131
7.4. Доклиническое изучение in vivo эффективности и переносимости комбинаций с L-лизин альфа-оксидазой 135
7.4.1. Оценка «острой» токсичности L-лизин-альфа-оксидазы и препаратов для комбинаций 135
7.4.2. Эффективность и переносимость комбинации иринотекана с L-лизин-альфа-оксидазой 138
7.4.3. Эффективность и переносимость комбинации цисплатин + L-лизин-альфа-оксидаза 143
7.4.4. Эффективность и переносимость комбинированной терапии этопозид + L-лизин-альфа-оксидаза 146
Глава 8. Новые аспекты изучения механизмов действия и прогнозирования биологической активности ферментов 148
8.1. Оценка взаимосвязей «структура-функция» с использованием сайт-направленного мутагенеза L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum 148
8.2. Взаимосвязь между антипролиферативной и ферментативной активностью 1 8.2.1. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ 155
8.2.2. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-метионин-у-лиаз 164
8.3. Прогнозирование иммуногенности и анализ структуры эпитопов L-аспарагиназ 165
8.4. Влияние L-метионин-у-лиазы на отдельные звенья механизма индукции апоптоза 169
Глава 9. STRONG Обсуждение полученных данных с оценкой перспектив поиска и экспериментального
изучения ферментов с противоопухолевой активностью STRONG 171
9.1. Поиск и создание ферментов с противоопухолевой активностью 171
9.2. Анализ выбора продуцента фермента 176
9.3. Прогнозирование антипролиферативной активности на основании кинетических характеристик фермента 177
9.4. Прогнозирование основных фармакокинетических параметров противоопухолевого фермента у человека на основе данных in vivo 180
9.5. Оценка очередности использования ферментных препаратов одной группы с учетом перекрестной иммуногенности 181
9.6. Алгоритм экспериментального изучения антипролиферативной активности потенциальных противоопухолевых ферментов 182
9.7. Особенности выбора препаратов для комбинированного применения с противоопухолевыми ферментами 186
9.8. Новые подходы к экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов 187
Выводы 189
Практические рекомендации 191
Благодарности 193
Литература
