Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. ДНК-метилтрансферазы млекопитающих 9
1.1.1. ДНК-метилтрансфераза 1 12
1.1.2. Семейство ДНК-метилтрансфераз 3 19
1.2. Биологическая роль метилирования днк у млекопитающих 24
1.3. Современные подходы к изучению системы метилирования днк 33
1.3.1. Методы, основанные на применении 5-метилцитозин-специфичных антител 34
1.3.2. Методы, основанные на бисульфитной конверсии ДНК 34
1.3.3. Методы, основанные на применении метилчувствительных и метилзависимых эндонуклеаз рестрикции 40
1.4. деметилирование ДНК 44
1.5. Ингибирование мтаз 47
2. Материалы и методы 53
2.1. Материалы 53
2.1.1. Олигодезоксирибонуклеотидные ингибиторы Dnmtl 53
2.1.2. Клеточные линии 56
2.1.3. Праймеры и TaqMan-зонды 57
2.2. Методы 58
2.2.1. Измерение скоростей реакции метилирования ДНК 58
2.2.2. Изучение внутриклеточной локализации олигонуклеотидов в клетках 60
2.2.3. Исследование цитотоксичности и ингибирующей активности олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl 61
2.2.4. Выделение ДНК из клеток 61
2.2.5. GLAD-ПЦР анализ статуса метилирования ДНК 62
3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Дизайн олигонуклеотидов, специфичных к Dnmtl 64
3.2. Субстратные свойства синтетических олигонуклеотидных структур 65
3.3. Ингибиторные свойства олигонуклеотидных структур в отношении активности Dnmtl 69
3.4. Локализация олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl в клетках карцином шейки матки 74
3.5. Оценка цитотоксичности олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl 78
3.6. Адаптация метода GLAD-ПЦР для анализа статуса метилирования ДНК 81
3.7. Оценка деметилирующего эффекта ингибиторов на гиперметилированные регуляторные районы генов-супрессоров опухолей 88
3.8. Заключение 93
4. Выводы 96
Список сокращений и условных обозначений 97
Список литературы
