ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................4
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ...................................................................................................................11
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................11
1.1. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция ....................................................11
1.1.1. Респираторно-синцитиальный вирус......................................................................12
1.1.1.1. Структурно-функциональная организация РСВ...............................................12
1.1.1.2. Жизненный цикл РСВ. ........................................................................................15
1.1.2. Механизм иммунного ответа при РСВИ .....................................................................18
1.1.2.1. Врожденный иммунный ответ на респираторно-синцитиальный вирус .......19
1.1.2.2. Адаптивный иммунный ответ при РСВИ..........................................................20
1.1.2.3. Роль белков РСВ в уклонении от иммунного ответа. ......................................24
1.1.3. Феномен усиления патологии после вакцинации против РСВ............................25
1.1.4. Подходы к созданию новых вакцин против РСВ..................................................26
1.1.5. Т-клеточные вакцины...............................................................................................31
1.2. Вирус гриппа..................................................................................................................32
1.2.1. Использование вируса гриппа А в качестве вектора ............................................33
1.2.1.1. Преимущества использования гриппозного вектора. ......................................34
1.2.1.2. Потенциальные недостатки векторов вируса гриппа.......................................35
1.2.3. Варианты векторов вируса гриппа. Сегменты, используемые для встраивания
трансгена...................................................................................................................................37
1.2.3.1. Ген гемагглютинина HA .....................................................................................37
1.2.3.2. Ген нейраминидазы NA.......................................................................................38
1.2.3.3. Ген полимеразного белка PB-2...........................................................................40
1.2.3.4. Ген М.....................................................................................................................41
1.2.3.5. Ген неструктурных белков NS............................................................................41
1.2.4. Модуляция иммунного ответа белком NS1 ...........................................................42
1.2.4.1. Структурная организация белка NS1.................................................................43
1.2.4.2. Механизмы ингибирования белком NS1 врожденных иммунных ответов ...44
1.3. Сигнальные пептиды.....................................................................................................46
1.4. Заключение по обзору литературы..............................................................................48
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................50
2.1. Материалы исследования .............................................................................................50
2.1.1. Клеточные культуры............................................................................................50
2.1.2. Вирусы ..................................................................................................................50
2.1.3. Куриные эмбрионы..............................................................................................51
2.1.4. Лабораторные животные.....................................................................................51
3
2.2. Методы исследования...................................................................................................51
2.2.1. Вирусологические методы..................................................................................51
2.2.2. Иммунологические методы ................................................................................56
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.........................................................................................................60
3.1. Конструирование гриппозного вектора с люциферазным репортером для оценки
поверхностной экспрессии белка NS1.......................................................................................60
3.1.1. Получение и характеристика репортерного вектора..................................................60
3.1.2. Оценка экспрессии трансгена NanoLuc in vitro и in vivo ...........................................62
3.2. Получение и характеристика набора гриппозных векторов с модифицированным NS1
белком, экспрессирующих РСВ антиген...................................................................................64
3.2.1. Конструирование плазмид, кодирующих ген NS со вставкой антигенов белка F
РСВ............................................................................................................................................64
3.2.2. Изучение экспрессии трансгена РСВ в зараженных клетках....................................70
3.3. Оценка безопасности и протективной эффективности векторов вируса гриппа при
однократном интраназальном введении мышам......................................................................73
3.3.1. Мониторинг динамики веса и оценка вирусной нагрузки в легких мышей после
однократной иммунизации векторами ..................................................................................73
3.3.2. Оценка вирусной нагрузки в легких мышей после инфекции РСВ ....................75
3.3.3. Гистологическая оценка срезов легочной ткани иммунизированных мышей
после инфекции РСВ ...............................................................................................................77
3.4. Изучение параметров врожденного иммунного ответа.............................................80
3.5. Изучение параметров адаптивного иммунного ответа после однократной
иммунизации векторами .............................................................................................................82
3.5.1. Изучение антительного иммунного ответов после иммунизации векторами ....82
3.5.2. Изучение Т-клеточного иммунного ответов после однократной иммунизации
векторами..................................................................................................................................85
3.6. Изучение параметров иммунного ответа в ходе РСВ инфекции у
иммунизированных животных...................................................................................................91
3.6.1. Изучение антительного иммунного ответов после иммунизации векторами ....91
3.6.2. Изучение Т-клеточного иммунного ответа у иммунизированных животных в
ходе инфекции РСВ.................................................................................................................91
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................................................95
ВЫВОДЫ ...................................................................................................................................105
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................108
