ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………. 5
ГЛАВА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ПЕРВИЧНЫХ
И ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЯХ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ)………………………………………………………………….16
1.1. Первичные иммунодефицитные состояния……………………………....16
1.2. Первичные иммунодефициты, выявляемые у взрослых людей…………17
1.3. Вторичные иммунодефицитные состояния............................................. …20
1.4. Роль клеток адаптивного иммунитета в развитии иммунодефицитных
состояний ......................................................................................................... …..22
1.5. Методы, применяемые для оценки иммунного статуса… ................. …..24
1.6. Генетическая рекомбинация антигенраспознающих рецепторов……….26
1.6.1. Формирование эксцизионных колец TREC и KREC…………….26
1.6.2. Процессы генетической рекомбинации, характерные для
большинства дифференцирующихся Т- и В-клеток…………………...……...32
1.7. Доступные методы количественной оценки TREC и KREC в
периферической крови…………………………………………………………..34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………...37
2.1. Характеристика биологического материала................................................ 37
2.2. Отбор и транспортировка образцов ............................................................. 39
2.3. Экстракция нуклеиновых кислот ................................................................. 40
2.4. Амплификация нуклеиновых кислот.......................................................... 41
2.5. Количественная оценка уровней TREC и KREC....................................... 44
2.6. Фенотипирование клеток крови .................................................................. 45
2.7. Статистический анализ.................................................................................. 46
2.8. Оценка аналитических характеристик разработанного метода ................ 47
2.8.1. Оценка аналитической специфичности……………………...…...473
2.8.2. Оценка предела обнаружения и аналитического диапазона
измерений…………………………………………………………………….......47
2.8.3. Оценка линейности измерений……………………………………48
2.8.4. Оценка точности измерений…………………………………….....48
2.8.5. Оценка воспроизводимости результатов……………...………….49
2.9. Оценка вклада ошибок преаналитического этапа в количественный
результат анализа .................................................................................................. 50
2.10. Сравнение методов экстракции нуклеиновых кислот.............................. 50
2.11. Оценка эквивалентности результатов анализа при работе с цельной
кровью и сухими каплями крови......................................................................... 52
2.12. Оценка показателей диагностической значимости разработанного
метода……………………………………………………………………………..52
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА
ДНК-ФРАГМЕНТОВ TREC И KREC В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НА
ОСНОВЕ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ……………..………...56
3.1. Выбор нормировочных генов ....................................................................... 56
3.2. Подбор компонентов реакции и условий амплификации.......................... 57
3.3. Подготовка калибраторов.............................................................................. 59
3.4. Оценка результатов........................................................................................ 63
ГЛАВА 4. ОПИСАНИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК
РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА………………………………………………...69
4.1. Аналитическая специфичность..................................................................... 69
4.2. Аналитическая чувствительность ................................................................ 70
4.3. Линейность измерений .................................................................................. 70
4.4. Точность измерений....................................................................................... 72
4.5. Внутрисерийная и межсерийная воспроизводимость............................... 73
ГЛАВА 5. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАЗРАБОТАННОГО
ПЦР-МЕТОДА…………………………………………………………………...774
5.1. Определение референтных интервалов уровней ДНК-молекул TREC и
KREC в периферической крови....................................................................... …77
5.2. Особенности преаналитического этапа при количественном определении
TREC/KREC в периферической крови................................................................ 79
5.2.1. Влияние ошибок пробоподготовки на количественный результат
анализа TREC/KREC при работе с картами Гатри…………………………….79
5.2.2. Влияние выбора метода экстракции ДНК из сухих капель крови
на определяемые уровни TREC/KREC………………………………...……….88
5.2.3. Оценка эквивалентности результатов при использовании в
качестве исследуемого материала цельной крови и сухих капель крови……92
5.3. Диагностическая значимость разработанного ПЦР-метода……………...94
5.3.1. Оценка диагностической значимости метода при первичных
иммунодефицитных состояниях………………………………...……………...94
5.3.2. Оценка диагностической значимости метода при инфекционных
заболеваниях…………………………………………………………...……….100
5.3.2.1. Уровни TREC и KREC у ВИЧ-инфицированных лиц………..100
5.3.2.2. Уровни TREC и KREC у пациентов с новой коронавирусной
инфекцией COVID-19………………………………...………………………..107
ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………………….120
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………128
ВЫВОДЫ............................................................................................................. 129
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................................. 130
Перспективы дальнейшей разработки темы исследования ............................ 131
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ……………………………..132
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...134
