Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Введение 7
2.2. Механизм восприятия боли 9
2.2.1. Ноцицепторы 9
2.2.2. Передача болевого сигнала 11
2.3. TRP семейство 12
2.3.1. Эволюция TRP семейства 13
2.3.2. Характерные структурные свойства 16
2.3.3. Локализация TRP каналов и их функции 19
2.4. Рецептор TRPA1 23
2.4.1. История открытия 23
2.4.2. Структура рецептора TRPA1 25
2.4.3. Физиологические функции рецептора TRPA1 31
2.4.3.1. Хемочувствительность 31
2.4.3.2. Термочувствительность 36
2.4.3.3. Механочувствительность 40
2.5. Патофизиологические процессы с участием TRPA1 41
2.6. Модуляторы рецептора TRPA1 и их клинические перспективы 48
2.6.1. Агонисты TRPA1 49
2.6.2. Антагонисты TRPA1 52
2.6.3. Кандидаты в клинические исследования и лекарственные препараты 57
3. Материалы и методы 60
3.1. Материалы и оборудование 60
3.1.1. Реактивы и материалы 60
3.1.2. Биологический материал и животные 60
3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 61
3.1.4. Среды для выращивания бактерий 61
3.1.5. Оборудование 61
3.2. Методы 63
3.2.1. Получение и подготовка образцов ядов актиний 63
3.2.2. Выделение активных компонентов из ядов актиний 64
3.2.3. Масс-спектрометрический анализ (МС) 64
3.2.4. Восстановление дисульфидных связей и алкилирование SH-групп 65
3.2.5. Анализ аминокислотной последовательности 66
3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности предшественников 66
3.2.7. Синтез генов, кодирующих пептиды 67
3.2.8. Получение рекомбинантных аналогов пептидов 69
3.2.9. ЯМР-спектроскопия 69
3.2.10. Биоинформационные методы 71
3.2.11. Т естирование антимикробной активности 71
3.2.12. Тестирование активности на TRPA1 рецепторе 72
3.2.12.1. Кальциевый имиджинг на клетках CHO 72
3.2.12.2. Кальциевый имиджинг на DRG нейронах 73
3.2.12.3. Электрофизиологическое тестирование 74
3.2.13. Тестирование на животных моделях 75
3.2.13.1. Анализ болевого поведения, вызываемого веществом 76
3.2.13.2. Тест «Открытое поле» для изучения поведения мышей 76
3.2.13.3. AITC-индуцируемое ноцицептивное поведение 76
3.2.13.4. CFA-индуцируемое воспаление и тепловая гипералгезия 77
3.2.13.5. Капсаициновый тест 77
4. Результаты и обсуждения 78
4.1. Выделение пептидных модуляторов из ядов морских анемон и установление их структуры 78
4.1.1 Полипептид из яда актинии Metridium senile 78
4.1.2 Полипептид из яда актинии Urticina eques 83
4.2. Получение рекомбинантных аналогов пептидов 94
4.2.1. Получение рекомбинантного аналога Ms 9a-1 94
4.2.2. Получение рекомбинантного аналога Ueq 12-1 94
4.3. Исследование биологической активности пептидов in vitro 95
4.3.1. Исследование активности пептида Ms 9a-1 96
4.3.1.1. Потенциирование AITC-индуцированного ответа клеток CHO-rTRPA1.96
4.3.1.2. Электрофизиологическое тестирование на ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих rTRPA1 97
4.3.1.3. Исследование на DRG нейронах, экспрессирующих TRPA1 99
4.3.2. Исследование активности пептида Ueq 12-1 101
4.3.2.1. Антибактериальная активность 101
4.3.2.2. Потенцирующий эффект пептида на активность рецептора TRPA1 102
4.4. Исследование биологической активности пептидов in vivo 104
4.4.1. Исследование активности пептида Ms 9a-1 на мышах 106
4.4.2. Исследование активности пептида Ueq 12-1 на мышах 109
5. Заключение 113
6. Выводы 116
7. Список сокращений 117
Ссылки 119
