Введение
1. Введение 7
2. Белки, содержащие CBS-домены (обзор литературы)
2.1. Цистатионин--синтаза (CBS) 11
2.2. АМР-активируемая протеинкиназа (AMPK) 15
2.3. Инозин-5-монофосфатдегидрогеназа (IMPDH) 18
2.4. Магний-селективный канал MgtE 22
2.5. Семейство хлорид-транспортирующих белков ClC 24
2.6. Растительные белки семейства CBSX 27
2.7. CBS-РРаза
2.7.1. Канонические РРазы семейства II 28
2.7.2. CBS-РРаза 31
2.8. CBS-белки: Заключение 33
3. Экспериментальная часть 41
3.1. Материалы 41
3.2. Методы
3.2.1. Биоинформатический анализ 42
3.2.2. Сайт-направленный мутагенез
3.2.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 42
3.2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 42
3.2.2.3. Ферментативная обработка ДНК 43
3.2.2.4. Подготовка компетентных клеток и трансформация 43
3.2.2.5. Выделение плазмидной ДНК
3.2.3. Работа с клетками E. coli 44
3.2.4. Определение концентрации белков 46
3.2.5. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях 46
3.2.6. Измерение скорости гидролиза PPi 46
3.2.7. Изотермическое калориметрическое титрование 47
3.2.8. Аналитическое ультрацентрифугирование 47
3.2.9. Химическое сшивание белков
3.2.10. Расчёт концентраций ионов металлов 48
3.2.11. Математическая обработка данных 48
3.2.12. Молекулярная динамика 48
4. Результаты и их обсуждение 50
4.1. Четвертичная структура CBS-РРазы и её значение для активности 50
4.1.1. CBS-РРазы имеют димерную структуру 50
4.1.2. Обратимая диссоциация Dh-РРазы 53
4.2. Кооперативность в катализе и регуляции CBS-РРазы 59
4.2.1. Кооперативность гидролиза субстрата CBS-РРазами 59
4.2.2. Отсутствие кинетической кооперативности в CDC-Dh-РРазе 64
4.2.3. Кооперативность связывания аденозинолигофосфатов CBS-РРазами 65
4.2.4. Влияние аденозинолигофосфатов на кинетическую кооперативность 72
4.2.5. Активность CBS-РРаз как функция отношения ADP:ATP 73
4.3. Диаденозинполифосфаты как регуляторы CBS-РРазы 75
4.3.1. Влияние ApnA на активность CBS-РРаз при постоянной концентрации свободных ионов магния 75
4.3.2. Зависимость уровня активации CBS-РРаз от концентрации свободных ионов магния 78
4.3.3. Анализ активации CBS-РРаз по уравнению Михаэлиса-Ментен 79
4.3.4. Термодинамика и стехиометрия связывания фосфатных производных аденозина с CBS-РРазами 83
4.4. Роль остатка аспарагина в передаче информации между каталитическими и регуляторными центрами 87
4.4.1. Eh-РРаза содержит мутацию в консервативном мотиве 88
4.4.2. Eh-РРаза не проявляет кинетическую кооперативность и не регулируется адениновыми производными 88
4.4.3. Замена N312S в Dh-РРазе устраняет кинетическую кооперативность и обращает эффект Ap4A на последнюю 91
4.4.4. N312S-Dh-РРаза сохраняет кооперативность связывания производных аденозина 94
4.4.5. Мутация не влияет на термодинамику связывания производных аденозина 97
4.4.6. Молекулярно-динамическое моделирование подтвердило важность остатка аспарагина для взаимодействия активных центров CBS-РРазы 98
5. Заключение 102
Приложение 107
Список использованной литературы 112
