Введение
Обзор литературы. 11
I. Gcn5-содержащие комплексы многоклеточных. 11
Транскрипция и ацетилирование 11
Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции . 12
Два различных GCN5-содержащих комплекса многоклеточных и их состав. 14
GCN5-содержащие STAGA/TFTC-подобные комплексы массой 2 МДа. 14
GCN5-содержащие АТАС комплексы массой 700 кДа. 16
Трехмерная структура SAGA/TFTC-подобных комплексов. 18
Функции GCN5-содержащих комплексов. 19
II. Экспорт мРНК и транскрипция. 24
Рецептор и адаптеры экспорта мРНК. 24
TREX комплекс. 25
Sac3-Thpl-Susl-Cdc31 комплекс. 26
III. Транскрипция на периферии ядра. 28
Эпигенетическое состояние генома. 28
Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия. 29
Репрессия теломер у дрожжей. 29
Ядерная ламина и репрессия генов. 31
Транскрипционно активные гены на периферии ядра . 32
Факторы, влияющие на связывание транскрипционно активных генов с NPC. 34
Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам. SAGA комплекс участвует в организации связывания генов с IV. Инсуляторы.
Организация эукариотических геномов. Su(Hw) - зависимые инсуляторы.
Строение и белковый состав Би(Нм>)-инсуляторов.
Энхансер-блокирующая активность 5и(Ну^)-инсуляторов.
Барьерная активность 8и(Нм?)-инсуляторов. Модели функционирования инсуляторов.
Экспериментальная часть.
I. Объект и задачи исследования. И. Материалы и методы.
1. Материалы.
Штаммы и вектора S. cerevisiae и Е. Coll
Клеточные линии.
Библиотека кДНК.
Эмбриональный ядерный экстракт.
Дрожжевые и бактериальные среды.
Ферменты и реактивы.
Антитела.
Праймеры.
Конструкции для двухгибридного скрининга.
Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков .
Конструкции для трансформации S2 клеток.
2. Работа с дрожжами.
3. Работа с клетками. Трансформация S2 клеток. 56
РНК интерференция. 56
4. Работа с ДНК. 56
Приготовление компетентных клеток. 56
Трансформация бактерий. 57
Щелочное выделение плазмидной ДНК. 57
Обработка ДНКрестриктазами. 5 7
Лигирование. 57
Выделение геномной ДНК из мух 58
Гель-электрофорез ДНК. 5 8
РСД. 58
Секвенирование ДНК. 59
5. Работа с РНК. 59
Получение двухцепочечной РНК. 59
Выделение РНК. 59 RT-PCR. 59
Нозери-блот анализ. 60
6. Работа с белками. 61
Экспрессия и очистка рекомбипантных белков . 61
Связывание белков на глютатион-сефарозе. 61
Получение антител и их очистка. 62
Белковый гель-электрофорез. 62
Вестерн-блот анализ 63
Соосаждение белков антителами. 63
Дот-блот анализ. 63
7. Иммуноокрашивание. 64
Иммуноокрашивание политенных хромосом. 64
Иммуноокраишвание S2 клеток. 65
8. Гибридизация in situ. 66
РНК in situ гибридизация с СуЗ-oligo-dT праймером. 66
ДНК in situ гибридизация с зондом к индивидуальному гену. 66
9. Электронная микроскопия. 67
10. Анализ изображений. 68
11. Хроматиниммунопреципитация. 68
12. Использованное программное обеспечение. 69
III. Результаты.
