Введение
Литературный обзор 10
1. Рак яичников 10
1.1. Злокачественные новообразования 10
1.2. Рак яичников 11
1.3. Современные методы диагностики рака яичников 13
2. Протеомные технологии для поиска новых маркеров онкологических заболеваний 17
2.1. Протеомика и пептидомика 17
2.2. Масс-спектрометрия – основной инструментальный метод протеомики
2.2.1. Методы ионизации биологических макромолекул 21
2.2.2. Основные типы масс-анализаторов 23
2.2.3. Тандемная масс-спектрометрия 25
2.2.4. LC-MS/MS – тандемная масс-спектрометрия, сопряженная с высокоэффективной жидкостной хроматографией 26
2.2.5. Методы количественного масс-спектрометрического анализа 27
2.3. Биоинформатические подходы в протеомике 29
2.3.1 Построение математических моделей классификации 30
2.3.2 Идентификация пептидов и валидация результатов идентификации 31
2.4 Кровь, как объект биомаркерных исследований 33
2.4.1 Плазма и сыворотка крови 34
2.4.2. Гипотеза образования пептидных биомаркеров 35
2.4.3. Основные сложности протеомных и пептидомных исследований производных крови 38
2.4.4. Методы выделения пептидов из плазмы/сыворотки крови
2.4.4.1. Ультрафильтрация 40
2.4.4.2. Преципитация белков органическими растворителями 40
2.4.4.3. Твердофазная экстракция 41
2.4.4.4. Выделение пептидов на хроматографических сорбентах с ограниченным доступом к сорбционным центрам 44
2.4.4.5 Деплеция основных белков плазмы/сыворотки крови 45
2.4.5 Методы десорбции пептидов с поверхности основных белков
плазмы крови 45
2.4.6. Использование масс-спектрометрии для поиска в плазме и сыворотке крови потенциальных маркеров онкологических заболеваний 46
2.4.7. Современные достижения в области поиска белковых/пептидных биомаркеров рака яичников 48
Материалы и методы 52
1. Образцы сыворотки крови 52
2. МАЛДИ МС профилирование сыворотки крови 54
2.1 Фракционирование образцов сыворотки крови 54
2.1.1 Протокол фракционирования с использованием MB-WCX 55
2.1.2 Протокол фракционирования с использованием MB-HIC 8 (18) 55
2.1.3 Протокол фракционирования с использованием MB-IMAC Cu 2.2. Стадия прогревания элюатов образцов сыворотки крови 57
2.3. МАЛДИ масс-спектрометрическое оборудование 57
2.4. Анализ масс-спектрометрических данных 58
3. Идентификация потенциальных пептидных биомаркеров 60 3.1 Фракционирование образцов сыворотки крови 60
3.1.1 Протокол фракционирования с использованием MB-WCX 60
3.2 Стадия прогревания элюатов образцов сыворотки крови 60
3.3 Обессоливание на микроколонках с обращено фазовой поверхностью 61
3.3.1 Протокол фракционирования на микроколонках с обращено
фазовой поверхностью 61
3.4 Масс-спектрометрическое оборудование 61
3.5 Идентификация пептидов и биоинформатический анализ 62
4. Количественный анализ содержания пептидов в сыворотке крови методом SWATH 63
4.1 Масс-спектрометрическое оборудование 64
4.2 Биоинформатический анализ данных SWATH 64
Результаты 66
1. Метод выделения пептидов из сыворотки крови человека 66
1.1 Сравнение пептидного и белкового состава элюатов до и после прогревания 66
1.2 Прогревание белка Apolipoprotein A-I 69
2. Построение классификационных моделей 70
2.1 Фракционирование образцов сыворотки крови с использованием различных типов магнитных микрочастиц 70
2.2 Построение классификационных моделей на основе профилирования на магнитных микрочастицах MB-WCX 73
2.3 Построение классификационных моделей сравнения групп «рак яичников» и «номинальный контроль» 78
2.4 Влияние длительности инкубации крови до получения сыворотки на последующий масс-спектрометрический профиль 3. Идентификация потенциальных биомаркеров рака яичников 83
4. Анализ потенциальных биомаркеров количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH 89 5. Взаимосвязь результатов МАЛДИ масс-спектрометрического
профилирования и количественного анализа на основе метода SWATH 92
Обсуждение результатов 94
1. Преимущества, которые дает разработанный метод выделения пептидов из сыворотки крови человека 94
2. Кислотный гидролиз на стадии прогревания элюатов 95
3. Результаты МАЛДИ масс-спектрометрического профилирования образцов сыворотки крови 98
4. Идентификация пептидов в сыворотке крови человека 100
5. Количественный анализ пептидов в сыворотке крови 101
Заключение 106
Выводы 107
Благодарности 109
Список сокращениий и условных обозначений 110
Словарь терминов 112
Список литературы
