ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................... 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................ 12
1.1 Значение биологических препаратов в сельском хозяйстве, пищевой и
фармацевтической промышленности.......................................................................... 12
1.2 Применение биопрепаратов на основе антагонистических микроорганизмов для
защиты растений ........................................................................................................... 14
1.3 Применение в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе грибов рода
Penicillium....................................................................................................................... 16
1.4 Антимикробные пептиды (АМП), общая характеристика и применение......... 18
1.5 Возможность применения препаратов на основе статинов для защиты
сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов................ 21
1.6 Получение высокопродуктивных штаммов методом мутагенеза и последующей
селекцией........................................................................................................................ 26
1.6.1 Использование методов химического и физического мутагенеза................... 26
1.6.2 Способ отбора спонтанных мутаций ................................................................. 28
1.6.3 Отбор мутантов на основе изменения морфологического признака .............. 28
1.7 Условия культивирования штаммов-продуцентов.............................................. 28
1.7.1 Источники углерода ............................................................................................. 30
1.7.2 Источники азота ................................................................................................... 32
1.7.3 Минеральные элементы....................................................................................... 34
1.8 Организация и проведение биотехнологических процессов.............................. 34
1.8.1 Определение ключевых параметров биотехнологического процесса ............ 34
1.8.2 Используемое в биотехнологическом производстве ферментационное
оборудование.................................................................................................................. 37
1.8.3 Оборудование, предназначенное для отделения промежуточных
полупродуктов от конечного целевого продукта ....................................................... 40
1.8.4 Стабилизация целевых материалов................................................................... 42
Заключение .................................................................................................................... 43
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ....................................................................... 44
3
2.1 Материалы исследований....................................................................................... 44
2.1.1 Химические реактивы, использованные в данной работе ............................... 44
2.1.2 Микроорганизмы, использованные в работе..................................................... 45
2.1.3 Среды и условия культивирования..................................................................... 45
2.1.3.1 Состав сред для поддержания микроорганизмов .......................................... 45
2.1.3.2 Приготовление питательных сред ................................................................... 46
2.1.3.3 Приготовление картофельно-глюкозного агара (КГА) .................................. 47
2.1.3.4 Культивирование микроорганизмов на твердой агаризованной среде ........ 47
2.1.4 Ферментационные установки для культивирования штамма P. chrysogenum47
2.1.4.1 Описание ферментационной установки №1 ................................................. 48
2.1.4.2 Описание ферментационной установки №2................................................... 49
2.1.4.3 Описание ферментационной установки №3................................................... 51
2.1.4.4 Описание высокоскоростной центрифуги ...................................................... 52
2.1.4.5 Описание лиофильной сушилки...................................................................... 54
2.2 Методы исследований............................................................................................. 56
2.2.1 Получение штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D с помощью
ненаправленного индуцированного мутагенеза......................................................... 57
2.2.2 Очистка и фракционирование белков ................................................................ 58
2.2.2.1 Приготовление осветленного лизата ............................................................... 58
2.2.2.2 Высаливание белков из раствора..................................................................... 59
2.2.2.3 Диализ................................................................................................................. 59
2.2.3 Анализ методом SDS-ПААГ электрофореза ..................................................... 60
2.2.3.1 Пробоподготовка образцов белка .................................................................... 60
2.2.3.2 Электрофорез..................................................................................................... 61
2.2.3.3 Визуализация геля методом окрашивания серебром..................................... 62
2.2.4 Изучение влияния белков P. chrysogenum на метаболическую активность
фитопатогенных грибов................................................................................................ 64
2.2.5 Определение содержания мевастатина в культуральной жидкости методом
ВЭЖХ ............................................................................................................................. 65
2.2.6 Определение содержания биомассы в культуральной жидкости.................... 67
4
2.2.7 Исследование противогрибной активности методом радиального роста ...... 68
2.2.8 Статистическая обработка данных..................................................................... 69
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ............................................................ 70
3.1. Получение штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D, обладающего повышенной
противогрибной активностью...................................................................................... 70
3.1.1 Построение кривой выживаемости P. chrysogenum ВКПМ F-1310 ................ 70
3.1.2. Отбор изолятов и оценка противогрибной активности................................... 71
3.2 Определение вторичных метаболитов в биомассе P. chrysogenum ВКМ F4876D…………………………………………………………………………………..72
3.2.1. Идентификация мевастатина.............................................................................. 72
3.2.2. Результаты электрофореза белковых фракций, выделенных из биомассы P.
chrysogenum ВКМ F-4876D .......................................................................................... 73
3.2.3 Изучение влияния белков, выделенных из биомассы P. chrysogenum F-4876D
на метаболическую активность гриба B. cinerea и F. oxysporum.............................. 76
3.3 Оптимизация состава питательной среды ............................................................ 76
3.3.1 Изучение влияния источника углерода на биосинтез мевастатина и накопление
биомассы P. chrysogenum ВКМ F-4876D..................................................................... 77
3.3.2 Влияние источников органического азота на биосинтез мевастатина и
накопление биомассы в культуральной жидкости P. chrysogenum ВКМ F-4876D . 79
3.3.3 Изучение влияния дополнительных источников азота на рост P. chrysogenum
ВКМ F-4876D и биосинтез мевастатина..................................................................... 82
3.3.4 Изучение влияния минеральных солей на накопление мевастатина и биомассы
P. chrysogenum ВКМ F-4876D ...................................................................................... 84
3.4 Оптимизация количества сахара в питательной среде для культивирования
штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D........................................................................ 86
3.5 Культивирование штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D в ферментационной
установке объёмом 15 литров ...................................................................................... 87
3.5.1 Культивирование штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D при нерегулируемом
режиме ферментации в ферментере объёмом 15 литров. ......................................... 87
5
3.5.2 Культивирование штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D в ферментационной
среде в режиме регулирования водородного показателя........................................... 90
3.5.3. Культивирование штамма P. chrysogenum ВКМ F-4876D на ферментационной
среде в условиях регулирования водородного показателя в культуральной жидкости
контроля и концентрации растворенного кислорода................................................. 91
3.7 Масштабирование процесса культивирования штамма P. chrysogenum ВКМ F4876D в ферментационной установке объемом 1000 л............................................. 95
3.8 Получение сухой биомассы P. chrysogenum ВКМ F-4876D................................ 98
3.9 Определение противогрибного эффекта сухой биомассы P. chrysogenum в
комбинации с химическими фунгицидами................................................................. 98
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................ 108
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 113
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 115
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 116
