Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Этапы развития и формирование субпопуляций NK-клеток 11
1.1.1 Развитие NK-клеток 11
1.1.2 Типы зрелых NK-клеток 16
1.2 Рецепторы NK-клеток 19
1.2.1 Рецепторы натуральной цитотоксичности 19
1.2.2 Лектин-подобные рецепторы 20
1.2.3 Иммуноглобулин-подобные рецепторы киллерных клеток KIR 22
1.2.4 Рецептор антитело-зависимой клеточной цитотоксичности CD16. 24
1.2.5 Взаимодействие активирующих и ингибирующих рецепторов 24
1.3 Функциональные характеристики NK-клеток 26
1.3.1 Продукция цитокинов 26
1.3.2 Цитотоксичность NK-клеток 26
1.3.3 «Обучение» NK-клеток как механизм развития толерантности к нормальным клеткам организма 28
1.4 Терминальная дифференцировка и старение NK-клеток 29
1.4.1 Дифференцировка зрелых NK-клеток 29
1.4.2 Развитие «адаптивных» NK-клеток 30
1.4.3 «Старение» NK-клеток 32
1.5 Подходы к использованию NK-клеток в противоопухолевой иммунотерапии 34
1.6 Методы культивирования NK-клеток 38
1.6.1 Активация NK-клеток 38
1.6.2 Влияние стимуляции на фенотипические характеристики NK-клеток 42
1.6.3 Культивирование единичных NK-клеток 43
1.7 Методы модификации NK-клеток 44
1.7.1 Методы генетической модификации NK-клеток 45
1.8 Заключение 47
2 Материалы и методы 49
2.1 Материалы 49
2.1.1 Клеточные линии 49
2.1.2 Растворы 49
2.1.3 Антитела 50
2.1.4 Прочие реагенты и материалы 50
2.2 Методы 51
2.2.1 Выделение, стимуляция и инкубирование клеток и клонов NK-клеток 51
2.2.2 Генетические манипуляции с клетками 58
3 Результаты 62
3.1 Выбор условий стимуляции, приводящих к увеличению продолжительности жизни NK-клеток 62
3.1.1 Подбор условий начальной стимуляции NK-клеток для клонирования 63
3.1.2 Влияние условий культивирования клонов NK-клеток на их продолжительность жизни и уровень клеточной экспансии. 65
3.2 Изучение эффективности образования, экспансии и выживаемости клонов, полученных из различных субпопуляций NK-клеток человека 72
3.2.1 Анализ эффективности образования клонов, полученных из NK-клеток человека, различных по степени дифференцировки 72
3.2.2 Анализ эффективности образования клонов, из NK-клеток, различных по степени дифференцировки, активации либо по уровню экспрессии NKG2C. 73
3.2.3 Изучение продолжительности жизни клонов, полученных из различных субпопуляций NK-клеток человека . 75
3.2.4 Изучение экспансии долгоживущих клонов, полученных из различных субпопуляций NK-клеток человека. 80
3.3 Фенотипические особенности полученных клонов 82
3.3.1 Оценка стабильности экспрессии определенных при сортировке маркеров клонов NK-клеток 82
3.3.2 Изучение экспрессии маркеров, влияющих на функциональную активность клонов 87
3.3.3 Оценка стабильности уровня экспрессии NKG2A 91
3.4 Функциональная активность полученных клонов NK-клеток 93
3.4.1 Исследование функциональной активности клонов, полученных из различных субпопуляций 93
3.4.2 Исследование функциональной активности долгоживущих клонов 94
3.4.3 Изучение функциональной активности клонов после заморозки/разморозки 95
3.5 Увеличение продолжительности жизни NK-клеток с использованием генетических манипуляций 97
3.5.1 Разработка метода трансдукции NK-клеток 97
3.5.2 Изучение эффективности трансдукции различных субпопуляций NK-клеток 99
3.5.3 Изучение продолжительности жизни, фенотипических и функциональных особенностей трансдуцированных NK-клеток 103
3.5.4 Трансдукция клонов NK-клеток 107
4 Обсуждение 111
5 Выводы 124
6 Благодарности 125
7 Список сокращений 126
8 Литература 128
