Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Интроны как функциональные элементы генома 11
1.1.1 Представленность интронов у различных видов 11
1.1.2. Теории возникновения интронов 16
1.1.3. Консервативность интронов 17
1.1.4. Роль интронов в геноме 18
1.1.5. Интроны - источники некодирующих РНК 24
1.2. Ген Trithor-ax-like (Trt) D.melanogaster 27
1.2.1. Структура гена Trl 27
1.2.2. Транскрипция гена Trl 28
1.2.3. Регуляция экспрессии гена Trl 30
1.2.4. Доменная структура продукта гена Trl - белка GAGA (GAF) 33
1.2.5. ДНК-связывающая активность белка GAGA 37
1.2.6. Белок-белковые взаимодействия белка GAGA 40
1.2.7. GAF как модификатор структуры хроматина 42
1.2.7.1. Участие белка GAGA в регуляции экспрессии генов 43
1.2.7.2. Роль белка GAGA в функционировании различных регуляторных элементов 47
1.2.8. Взаимодействие белка GAGA с гетерохроматином и его влияние на деление клеток 53
1.2.9. Белок GAGA требуется для дозовой компенсации у самцов дрозофилы 54
1.2.10. Характеристика мутаций гена Trl 56
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Материалы, использованные в работе 60
2.2. Олигонуклеотиды 60
2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе 61
2.4. Анализ жизнеспособности 62
2.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии 62
2.6. Выделение геномной ДНК для использования в ПЦР 63
2.7. Выделение тотальной РНК из яичников и других тканей дрозофилы 63
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 64
2.9. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix 64
2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях 65
2.11. Получение Р32-меченых ДНК-зондов 65
2.12. Нозерн-блот гибридизация 66
2.13. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 66
2.14.Лигирование 66
2.15. Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli 66
2.16. Электропорация плазмидной ДНК в клетки Е. coli 67
2.17. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 67
2.18. Скрининг бактериальных колоний с помощью ПЦР 68
2.19. Трансформация генома дрозофилы ^-транспозонами 68
2.20. Детекция (3-галактозидазы в органах и тканях дрозофилы 69
2.21. Выделение ядерного экстракта из эмбрионов дрозофил 69
2.22. Метод торможения ДНК-пробы в геле 70
2.23. Выделение рекомбинантного белка 71
2.24. Вектор для трансформации эмбрионов дрозофил 72
Глава 3. Результаты и обсуждение 73
3.1. Получение мутаций по второму интрону гена Trl 73
3.2. Идентификация и картирование полученных мутаций 77
3.2.1. Отбор линий, несущих перестройки 77
3.2.2. Картирование полученных перестроек 80
3.3. Анализ жизнеспособности полученных мутантов 85
3.3.1. Частичное восстановление жизнеспособности мутантов ТгГ"1ТгГ3 при введении дополнительных кДНК копий гена Trl 90
3.4. Анализ экспрессии гена 7>/у мутантов Trl172 93
3.5. Выявление консервативных фрагментов во втором интроне гена Trl 94
3.6. Изучение связывания ядерных экстрактов и рекомбинантного белка
GAGA с последовательностями второго интрона 98
3.7. Выявление энхансерных элементов второго интрона гена Trl с помощью трансформации эмбрионов дрозофилы 108
Заключение 113
Выводы 117
Список литературы 118
