Введение
1. Структуры и функции токсинов - высокоспецифичных ингибиторов никотинового ацетилхолинового рецептора 8
1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор 8
1.2. Механизм активации канала 9
1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора 11
1.4. Конотоксины 15
1.5. НеЙротоксины из яда змей 18
1.6. Взаимодействие нейротоксинов с никотиновым ацетилхолиновьш рецептором 21
2. Получение а-нейротоксинов in vitro 30
2.1. Введение ЗО
2.2. Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. coli 30
2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксинов в E.coli 31
2.4. Продукция нейротоксинов в виде гибридов с другими белками в E.coli 33
2.5. Секреция нейротоксинов в E.coli 36
2.6. Твердофазный химический синтез 37
3. Материалы и методы 39
3.1 Материалы 39
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты 39
3.1.2. Штаммы 40
3.1.3. Плазмидные вектора 41
3.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур 41
3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды 42
3.2. Методы 44
3.2.1. Трансформация клеток coli плазмидной ДНК 44
3.2.1.1. Приготовление компетентных клеток 44
3.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК 45
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 45
3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 45
3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК 46
3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля 46
3.2.6. Олигонуклеотид-направленныймутагенез 46
3.2.7. Полимеразная цепная реакция 47
3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина П в виде слитной полипептидной цепи с геном гиоредоксина 47
3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II в клетках Ecoli 48
3.2.10. Выделение и очистка гибридного белка 49
3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II 50
3.2.12. Экспрессия гена нейротоксина П в секретирующей конструкции 50
3.2.13. Анализ локализации секретируемых нейротоксинов в клетках Е. coli 51
3.2.14. Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов 52
3.2.15. Аналитические методы 52
3.2.15.1. Электрофоретический анализ белков в SDS-ПААГ 52
3.2.15.2. Количественный анализ белковых препаратов 53
3.2.15.3. Определение //-концевой последовательности полипептидов 53
3.2.15.4. Масс-спектрометрический анализ белковых препаратов 53
3.2.16. Методы структурных исследований 54
3.2.16.1. СпектрьГН-ЯМР 54
3.2.16.2. Получение двумерных и трехмерных гетроядерных ЯМР-спектров 54
3.2.17. Методы биологических исследований 55
3.2.17.1. Анализ взаимодействия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica 55
3.2.17.2. Определение токсичности рекомбинантных токсинов 56
3.2.17.3. Определение константы ингибирования нейрональных нАХР рекомбинантным нейротоксином II и мутантными нейротоксинами 56
3.2.18. Построение молекулярных моделей 58
4. Результаты и обсуждение 59
4.1. Конструирование гена нейротоксина II 59
4.2. Конструирование гена тиоредоксина 60
4.3. Экспрессирующие вектора и биосинтез рекомбинантных токсинов в прокариотической системе (Е. coli) 63
4.3.1.1. Сборка экспрессирующей конструкции для наработки слитного белка тиоредоксин-нейротоксин П 63
4.3.1.2. Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином 68
4.3.1.3. Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II 69
4.3.1.4. ЯМР-спектроскопия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II 70
4.3.1.5. Биологические свойства гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II 72
4.3.1.6. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II 73
4.3.1.7. Анализ рекомбинантного нейротоксина II 74
4.3.2.1. Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II 75
4.3.2.2. Секреция рекомбинантного нейротоксина II 77
4.3.2.3. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II 78
4.3.2.4. Анализ рекомбинантного нейротоксина II 79
4.3.2.5. ЯМР-анализ рекомбинантного нейротоксина II 80
4.3.2.6. Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II 81
4.3.3.1. Биосинтез изотопно-меченых вариантов нейротоксина II 81
4.3.3.2. Выделение и очистка изотопно-меченых вариантов нейротоксина II 82
4.3.3.3. ЯМР-анализ чистоты и степени мечения препаратов изотопно-меченых вариантов нейротоксина II 82
4.3.3.4. Отнесение ЯМР спектров 84
4.3.3.5. Исследование взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами (анизотропной средой, моделирующей биологическую мембрану) 87
4.3.4.1. Конструирование мутантных вариантов нейротоксина II 91
4.3.4.2. Получение генов мутантных вариантов нейротоксина II mutl и mutll 94
4.3.4.3. Биосинтез мутантных вариантов нейротоксина II MutI и Mutll 95
4.3.4.4. Выделение и очистка мутантных вариантов нейротоксина II MutI и Mutll 95
4.3.4.5. Анализ рекомбинантных белков MutI и Mutll 95
4.3.4.6. ЯМР-анализ рекомбинантных белков MutI и Mutll 96
4.3.4.7. Анализ биологической активности рекомбинантных белков MutI и Mutll 97
Заключение 100
Выводы 101
