Введение
Обзор литературы 10
1. Пептидогликанлизирующие ферменты бактерифагов. 10
1.1. Пептидогликан – субстрат пептидогликанлизирующих ферментов . 10
1.1.1. Гликановая цепь 10
1.1.2. Пептидная часть пептидогликана 11
1.1.3. Межпептидный линкер 13
1.1.4. Вариации структуры пептидогликанов 14
1.1.5. Сайты гидролиза пептидогликана 15
1.2. Классификация пептидогликангидролаз. Строение и катализ 16
1.2.1. Ферменты, гидролизующие связи между остатками сахаров 16
1.2.2. Ферменты, гидролизующие связь между гликаном и пептидным фрагментом 20
1.2.3. Пептидазы 20
1.2.4. Структурная организация пептидогликангидролаз 22
1.3. Перспективы использования пептидогликангидролаз бактериофагов на практике 23
1.4. Количественное измерение ферментативной активности пептидогликанлизирующих ферментов 28
2. Внешняя мембрана E. coli и существующие подходы к ее дестабилизации 31
2.2. Липиды и липополисахариды 31
2.2.1. Липид А 33
2.2.2. Центральный олигосахарид 34
2.2.3. О-антиген 35
2.2.4. Общий энтеробактериальный антиген и другие капсульные полисахариды 36
2.3. Белки 41
2.3.1. Липопротеин Брауна 41
2.3.2. Порины 42
2.3.3. Аффинные рецепторы внешней мембраны 43
2.3.4. Белки, отвечающие за транспорт белков 44
2.4. Свойства внешней мембраны E. coli 44
2.4.1. Ассиметричность липидного бислоя 45
2.4.2. Физические свойства липополисахаридного слоя внешней мембраны 45
2.4.3. Барьерная функция внешней мембраны 46
2.5. Агенты, увеличивающие проницаемость внешней мембраны грамотрицательных бактерий. 47
2.5.1. Методы оценки проницаемости внешней мембраны грамотрицательных бактерий 48
2.5.2. Катионные агенты 49
3. Стабилизация ферментов 61
3.1. Модификация свойств среды 63
3.1.1. Стабилизация ферментов при помощи неорганических солей 63
3.1.2. Стабилизация ферментов с помощью осмолитов. 65
3.1.3. Стабилизация ферментов с помощью комплексообразования с полиэлектролитами 67
3.2. Химическая модификация белков 69
3.2.1. Стабилизация белков с помощью химической модификации функциональных групп 69
3.2.2. Стабилизация белков с помощью наложения внутримолекулярных и межмолекулярных сшивок 71
3.2.3. Стабилизация ферментов методом иммобилизации 73
3.2.4. Стабилизация ферментов методами белковой инженерии 78
Материалы и методы 82
4. Материалы 82
5. Методы
5.1. Полимеразная цепная реакция 85
5.2. Очистка фрагментов ДНК 85
5.3. Рестрикция 85
5.4. Электрофорез в агарозном геле 85
5.5. Лигирование фрагментов ДНК 86
5.6. Приготовление компетентных клеток E. coli 86
5.7. Трансформация клеток E. coli 86
5.8. Выделение плазмидной ДНК 87
5.9. Выделение Lys394
5.10. Приготовление субстрата для определения активности Lys394 88
5.11. Измерение активности Lys394 88
5.12. Изучение влияния рН и концентрации NaCl на активность Lys394 89
5.13. Изучение ингибирования активности Lys394 под действием ЭДТА и последующего востановления активности солями металлов . 89
5.14. Определение молекулярной массы активного фермента 90
5.15. Изучение спектра микроорганизмов, чувствительных к действию Lys394. 90
5.16. Определение увеличения проницаемости внешней мембраны E. coli 90
5.17. Изучение лизиса клеток E. coli под действием эндолизина бактериофага SPZ7 в присутствии колистина. 91
5.18. Лизис интактных клеток E. coli при совместном действии агентов, нарушающих целостность внешней мембраны E. coli. 91
5.19. Изучение термоинактивации Lys394 93
5.20. Изучение влияния добавок на активность и стабильность Lys394 93
Результаты экспериментов и их обсуждение 94
6. Выделение и очистка рекомбинантного эндолизина бактериофага S-394 94
6.1. Анализ последовательности аминокислот пептидогликангидролазы
бактериофага S-394 94
6.2. Создание генно-инженерных конструкций для получения рекомбинантного Lys394 98
6.3. Получение рекомбинантного Lys394 в клетках E. coli 100
6.3.1. Выбор штамма-продуцента 100
6.3.2. Подбор оптимальных значений температуры и концентрации индуктора. 103
6.3.3. Очистка рекомбинантного Lys394 104
7. Физико-химические свойства рекомбинантного Lys394 106
7.1. Ферментативная активность полноразмерного и укороченного Lys394 106
7.2. Субъединичная организация Lys394 . 113
7.3. Спектр гидролизуемых микроорганизмов 113
8. Применение рекомбинантного Lys394 снаружи клеток 116
8.1. Увеличение проницаемости внешней мембраны E. coli 116
8.1.1. Выбор агентов для увеличения проницаемости внешней мембраны E. coli 116
8.1.2. Взаимодействие гомополимеров аминокислот и катионных олигпептидов с интактными клетками E. coli 118
8.2. Лизис интактных клеток E. coli под действием Lys394 в присутствии агентов, разупорядочивающих внешнюю мембрану 123
8.2.1. Лизис суспензии клеток E. coli 124
8.2.2. Лизис газонных клеток E. coli 125
9. Термостабильность и стабилизация Lys394 128
9.1. Кинетика термоинактивации фермента Lys394 128
9.2. Стабилизация фермента Lys394 129
9.2.1. Стратегия стабилизации фермента Lys394 129
9.2.2. Влияние ионной силы и солевого состава буферного раствора на стабильность фермента Lys394 130
9.2.3. Стабилизация Lys394 с помощью полиолов 132
9.2.4. Стабилизация Lys394 с помощью поликатионов 134
9.2.5. Выбор оптимального сочетания эффекторов для стабилизации Lys394 136
Выводы 139
Список литературы 140
